Kloning Gen Penyandi Lipase Termofilik dari Isolat Bakteri Asal Mata Air Panas di Pulau Seram, Maluku
View/ Open
Date
2012Author
Apituley, Edwin Thomas
Suwanto, Antonius
Mubarik, Nisa Rachmania
Metadata
Show full item recordAbstract
Bakteri termofilik seringkali memiliki enzim yang stabil dan aktif pada
suhu tinggi yang bermanfaat untuk diaplikasikan dalam bidang bioteknologi dan
industri, seperti enzim lipase yang digunakan dalam reaksi hidrolisis dan
esterifikasi. Tujuan penelitian ini ialah untuk mengisolasi bakteri termofilik
penghasil lipase, mengkarakterisasi lipase yang dihasilkan, dan untuk mengisolasi
serta mengklon gen penyandi lipase.
Isolat T I.2 adalah bakteri termofilik yang diisolasi dari sumber mata air
panas yang terdapat di pulau Seram yang memiliki suhu 89°C dan pH 6,3. Isolasi
dilakukan menggunakan media Basal Salt Medium dengan minyak zaitun sebagai
sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri penghasil enzim lipase. Pembandingan
sekuen 16S rDNA terhadap basis data pada GenBank menggunakan Basic Local
Alignment Search Tools for nucleotides (BLASTn) menunjukkan bahwa isolat T
I.2 memiliki kekerabatan yang lebih dekat kepada Geobacillus stearothermophilus
dengan homologi 99%. Primer yang digunakan dikonstruksi oleh Marchesi et al
untuk amplifikasi gen 16S rRNA dan merupakan primer universal yang spesifik
terhadap domain bakteri,. Analisis filogenetik untuk 16S rRNA dilakukan dengan
menggunakan metode Neighbour Joining, dengan jarak diperkirakan
menggunakan metode Kimura two parameters dengan 100 bootstrap replicates.
Pohon filogenetik yang dikonstruksi menunjukkan bahwa isolat T I.2
mengelompok di antara anggota dari genus Geobacillus dan memiliki kemiripan
yang lebih dekat terhadap Geobacillus stearothermophilus.
Metode titrimetri digunakan untuk mengukur aktivitas lipase ekstrak kasar
dari isolat T I.2 pada berbagai suhu dan pH. Hasil yang diperoleh menunjukkan
aktivitas lipase optimal suhu 80°C dan pH 6,5. Prakiraan adanya gen lipase
dilakukan dengan mengamplifikasi fragmen gen lipase menggunakan primer yang
dikonstruksi oleh Bell et al. Primer tersebut tidak dapat mendeteksi adanya gen
lipase, untuk prakiraan keberadaan gen lipase pada isolat T I.2. Isolasi gen lipase
kemudian dilakukan dengan menggunakan pasangan primer yang dikonstruksi
oleh Jiang et al. Primer degenerate digunakan untuk menghasilkan beberapa
fragmen DNA dengan ukuran yang berbeda, dan fragmen yang berukuran kurang
lebih 1200 bp digunakan sebagai template untuk amplifikasi dengan
menggunakan pasangan primer F1-R1 yang dikonstruksi untuk amplifikasi gen
lipase beserta sekuen signalnya, dan primer F2-R1 untuk mengamplifikasi gen
lipase tanpa menyertakan signal sekuen. Pasangan primer F1-R1 hanya dapat
mengamplifikasi fragmen DNA berukuran 600 bp. Gen lipase isolat T I.2
berukuran 1180 bp berhasil diamplifikasi dengan menggunakan pasangan primer
F2-R1, dan diklon ke pGEM-T Easy sehingga diperoleh plasmid rekombinan
pGEM-TGeolipFull dengan ukuran 4204 bp. Plasmid rekombinan kemudian
ditransformasikan ke Escherichia coli TOP 10. Aktivitas enzim lipase ekstrak
kasar yang dihasilkan E.coli TOP 10 transforman yang membawa plasmid
rekombinan ialah sebesar 3,11 U/ml pada kondisi optimal yaitu suhu 80°C dan pH ..dst