Deteksi dan Identifikasi Molekuler Kapang Berpotensi sebagai Penghasil Patulin pada Buah-Buahan Tropis

Abstract

Produksi dan ekspor buah-buahan tropis Indonesia mengalami tren peningkatan dari tahun ke tahun. Salah satu faktor penting yang harus diperhatikan dalam produksi maupun ekspor buah-buahan ialah keamanan pangan. Salah satu cemaran yang dapat ditemukan pada buah adalah mikotoksin, khususnya patulin, yang merupakan hasil metabolit sekunder dari kapang. Patulin merupakan mikotoksin dengan kapang penghasil utamanya ialah Penicillium expansum yang sering ditemukan pada buah apel dan olahannya. Penelitian mengenai spesies kapang penghasil patulin pada buah-buahan tropis Indonesia masih terbatas. Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk memperoleh isolat kapang yang tumbuh dari empat jenis buah-buahan tropis, kondisi running optimum polymerase chain reaction (PCR) untuk deteksi gen target isoepoxydon dehydrogenase (idh), dan identitas kapang yang berpotensi sebagai penghasil patulin pada buah-buahan tropis. Penelitian terdiri dari tiga tahap yaitu (1) isolasi kapang dari buah-buahan tropis, (2) optimasi kondisi running PCR dan deteksi gen target idh pada isolat yang diperoleh, serta (3) identifikasi spesies kapang secara molekuler menggunakan gen target internal transcribed spacer (ITS) rDNA yang selanjutnya dilakukan analisis homologi sekuen DNA dengan sekuen yang terdapat di GenBank. Total 26 kapang diisolasi dari empat jenis buah (apel malang, pisang ambon, jeruk medan dan alpukat) yang diperoleh dari lima tempat yang berbeda di Bogor antara lain kios buah, pasar tradisional dan supermarket. Isolat yang diperoleh yaitu 13 isolat dari apel malang, 9 isolat dari pisang ambon, 2 isolat dari jeruk medan dan 2 isolat dari alpukat. Colletotrichum musae PA01 digunakan sebagai kontrol positif kapang penghasil patulin. Hasil optimasi metode PCR untuk deteksi gen idh menunjukkan suhu annealing 54ºC, reagen mix A, dan konsentrasi primer sebesar 0,2 µm merupakan kondisi yang optimum. Deteksi kapang berpotensi menghasilkan patulin dilakukan menggunakan gen target idh dengan primer forward IDH1 dan primer reverse IDH2. Kapang yang positif terdeteksi gen idh adalah isolat kapang yang mempunyai amplikon dengan ukuran 620 bp. Hasil visualisasi produk PCR deteksi gen penghasil patulin ditemukan sebanyak 5 dari 26 (19,2%) isolat yang positif mempunyai gen idh yaitu isolat dengan kode A11, A34, A43, A51, dan B23. Identifikasi spesies dilakukan menggunakan gen ITS rDNA dengan primer universal yaitu primer forward ITS1 dan reverse ITS4. Sekuen DNA isolat kapang selanjutnya dianalisis BLAST dan pohon filogenetik menggunakan sekuen DNA yang terdapat di GenBank sebagai rujukan. Pohon filogenetik dikonstruksi menggunakan metode Maximum Likelihood dengan model yang terbaik dan bootstrap 1000x pada perangkat lunak MEGA X. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat yang positif mengandung gen idh teridentifikasi sebagai Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Cladosporium antropophilum, Cladosporium tenuissimum, dan Talaromyces verruculosus.

Production and export of tropical fruits have an increasing trend every year. The important factor in the production and export of fruits is food safety. One of the contaminants that may be found in fruit is mycotoxin, especially patulin. The major producer of patulin is Penicillium expansum which is often found in apples and its products. Research on the identification of patulin-producing mold in Indonesian tropical fruit is still limited. This study aimed to obtain contaminant molds from tropical fruits, the optimum polymerase chain reaction (PCR) running condition for isoepoxydon dehydrogenase (idh) gene detection, and the identity of potentially patulin-producing mold. The research consisted of three stages, (1) isolation of molds from tropical fruits, (2) optimization of PCR running conditions and detection of patulin-producing molds with idh gene, and (3) species identification of molds with PCR method using the internal transcribed spacer (ITS) gene, then sequences and matched with the database. A total of 26 molds were isolated from four types of fruit (Malang apple, Ambon banana, Medan orange, and avocado) obtained from five different places in Bogor including fruit stalls, traditional markets, and supermarkets. The isolates obtained were 13 isolates from Malang apple, 9 isolates from Ambon banana, 2 isolates from Medan Oranges and 2 isolates from avocado. Colletotrichum musae PA01 as a positive control of patulin-producing mold. The result of PCR optimization for idh gene detection showed annealing temperature of 54ºC, reagent mix A, and primer concentration of 0,2 µm were the optimum conditions. Detection of potentially patulin-producing molds was carried out using idh gene with IDH1 as forward primer and IDH2 as reverse primer. The positive results were mold isolates that had an amplicon at 620 bp. The PCR product visualization result of patulin gene detection were found as many as 5 of 26 (19,2%) isolates were positive for idh gene, namely A11, A34, A43, A51 and B23. Species identification was carried out using universal primers with ITS1 as forward primer and ITS4 as reverse primer. The mold isolate sequences of ITS rDNA region was analyzed for their homology with that of available in GenBank using BLAST search. The ITS rDNA sequences were also further analysis using a phylogenetic tree. The phylogenetic tree was constructed using the Maximum Likelihood method with the best fit model and 1000x bootstrap on MEGA X software. The results showed that positive isolates having idh gene were identified as Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Cladosporium anthropophilum, Cladosporium tenuissimum, and Talaromyces verruculosus.