Potensi dan Identifikasi Komponen Antikapang Daging Biji Picung terhadap Spora Aspergillus flavus

Abstract

Masyarakat Indonesia secara turun-temurun terbiasa memanfaatkan sumber-sumber pangan yang beragam sebagai pemenuhan kebutuhan pangan sehari-hari. Hal ini membuat Indonesia memiliki berbagai macam pangan kearifan lokal, salah satunya adalah picung. Picung (Pangium edule Reinw.) merupakan salah satu pangan kearifan lokal Indonesia yang hingga saat ini masih sering digunakan sebagai bumbu masak. Biji picung dapat dimanfaatkan baik ketika masih segar, tua, maupun telah melalui proses fermentasi. Daging biji picung terfermentasi biasa digunakan sebagai bumbu masak, sedangkan daging biji picung segar dan tua biasa digunakan sebagai pengawet dan media fermentasi pada produk perikanan. Daging biji picung diduga memiliki potensi antikapang yang ditunjukkan dengan adanya produk ikan fermentasi yang disebut pado dengan memanfaatkan daging biji picung tua yang telah dikeringkan sebagai media fermentasi. Proses fermentasi pada produk pado dilakukan tanpa penggaraman, tetapi produk tersebut dapat disimpan selama 14 minggu pada suhu ruang setelah proses fermentasi selesai dengan tekstur dan bau yang tidak berubah serta tidak ditemukan lendir pada permukaannya. Namun, data-data ilmiah tentang peran daging biji picung dalam fermentasi produk perikanan belum banyak dilaporkan, terutama komponen aktif yang berperan dalam mempertahankan kualitas produk terhadap serangan kapang perusak, salah satunya kapang Aspergillus flavus. Kapang A. flavus merupakan salah satu kapang perusak pangan yang dapat memproduksi senyawa metabolik bersifat racun yang disebut aflatoksin. Toksin ini dapat menjadi faktor penyebab kanker hati. Negara Indonesia yang memiliki iklim tropis dapat memberikan kondisi optimal bagi pertumbuhan dan perkembangan kapang ini, sehingga pertumbuhannya harus dikontrol untuk meminimalisir risiko kontaminasi A. flavus. Berdasarkan latar belakang tersebut, tujuan umum penelitian ini adalah menguji potensi antikapang daging biji picung tua dan terfermentasi dengan berbagai pelarut ekstraksi terhadap germinasi spora A. flavus. Tujuan khusus penelitian ini adalah menentukan ekstrak kasar daging biji picung tua dan terfermentasi yang paling baik dalam menghambat germinasi spora A. flavus, menguji aktivitas antikapang fraksi hasil ultrafiltrasi terhadap germinasi spora A. flavus, mengevaluasi toksisitas ekstrak kasar daging biji picung tua dan terfermentasi terhadap larva Artemia salina Leach. berdasarkan nilai LC50, serta mengidentifikasi komponen aktif antikapang dalam fraksi hasil ultrafiltrasi dengan liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Sampel yang digunakan adalah biji picung tua yang diperoleh dari Kabupaten Padang Pariaman, Sumatera Barat dan biji picung terfermentasi yang diperoleh dari Kabupaten Nganjuk, Jawa Timur. Kedua sampel tersebut dianalisis warna dan komposisi kimianya meliputi kadar air, kadar abu, kadar lemak, kadar protein, dan kadar karbohidrat by difference yang merupakan tahap pertama pada penelitian ini. Selanjutnya, kedua sampel diekstraksi dengan metode maserasi bertingkat menggunakan pelarut air, etanol 50%, etil asetat, dan n-heksana, serta dihitung persentase rendemennya. Tahap kedua, yaitu karakterisasi ekstrak kasar daging biji picung yang meliputi pengujian aktivitas antikapang dengan uji dilusi agar dan pengujian fitokimia secara kualitatif. Tahap ketiga meliputi uji toksisitas untuk menentukan nilai LC50 dengan metode BSLT, fraksinasi komponen aktif antikapang dengan ultrafiltrasi, serta pengujian kembali aktivitas antikapang fraksi hasil ultafiltrasi dengan metode dilusi agar. Tahap ini dilakukan terhadap ekstrak kasar daging biji picung tua dan terfermentasi yang memiliki aktivitas penghambatan terbaik terhadap A. flavus yang ditandai dengan nilai minimum inhibitory concentration (MIC) terkecil. Tahap keempat dilakukan identifikasi dan karakterisasi fraksi hasil ultrafiltrasi terpilih dengan LC-MS/MS untuk memperoleh informasi komponen aktif yang memberikan aktivitas antikapang. Aktivitas penghambatan terbaik dari daging biji picung tua dan terfermentasi terhadap germinasi spora A. flavus ditemukan pada ekstrak kasar dengan pelarut ekstraksi air dengan nilai MIC 12,5 mg/mL dan 25 mg/mL, secara berturut-turut. Ekstrak air kemudian diuji toksisitas-nya dan difraksinasi dengan membran ultrafiltrasi 3 kDa, sehingga menghasilkan fraksi <3 kDa dan fraksi >3 kDa. Kedua fraksi hasil ultrafiltrasi kemudian diuji kembali aktivitas antikapang-nya dan menghasilkan nilai MIC 6,25 mg/mL pada fraksi <3 kDa ekstrak air daging biji picung tua dan 12,5 mg/mL pada fraksi <3 kDa ekstrak air daging biji picung terfermentasi. Ekstrak air yang sudah difraksinasi menunjukkan aktivitas antikapang yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak sebelum fraksinasi ditandai dengan nilai MIC yang lebih rendah. Toksisitas ekstrak air dari kedua jenis daging biji picung terhadap larva A. salina digolongkan dalam toksisitas sedang dengan LC50 100–500 μg/mL. Hasil analisis LC-MS/MS menunjukkan bahwa golongan senyawa asam lemak, asam amino, glikosida, dan peptida merupakan senyawa utama dalam ekstrak air daging biji picung, tetapi berdasarkan analisis mulitivariat, hanya golongan senyawa asam lemak dan glikosida yang bertanggung jawab (VIP > 1 dan r > 0,90) terhadap aktivitas antikapang ekstrak air daging biji picung tua dan terfermentasi.

Picung (Pangium edule Reinw) is one of local food wisdom in Indonesia which its fruit-seed is often used as spices. The fermented seeds are widely used in different culinary recipes, while the fresh and old seeds are commonly used as a preservative and fermentation medium in fishery products. The picung seed is thought to have antifungal potential which is indicated by the presence of a fermented fish product called pado by using dried old picung seed as a fermentation medium. The fermentation process of pado products usually done without salt, but the products can be stored for 14 weeks at room temperature after the fermentation process completed without texture and odor changed and there was no mold found on the surface. However, scientific data on the active compounds of picung seed that can prevent the growth of toxigenic Aspergillus flavus have not been widely reported. A. flavus can produce toxigenic metabolic compounds called aflatoxins. This toxin can be a factor causing liver cancer. Indonesia which has a tropical climate can provide optimal conditions for the growth of this mold, so its growth must be controlled to minimize the risk of A. flavus contamination. Based on this background, the general objective of this research is to examine the antifungal potency of old and fermented picung seeds with various extraction solvents on the germination of A. flavus spores. The spesific objectives of this research are to determine the crude extracts of old and fermented picung seeds which provide the best inhibitory activity on the germination of A. flavus spores, to examine the antifungal activity of ultrafiltration fraction on the germination of A. flavus spores, to evaluate the toxicity of crude extracts of old and fermented picung seeds on Artemia salina Leach. larvae based on LC50 value, and to identify the antifungal active compounds of crude extracts of old and fermented picung seeds in the fraction resulting from ultrafiltration by liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The samples were old picung seeds obtained from Padang Pariaman Regency, West Sumatra and fermented picung seeds obtained from Nganjuk Regency, East Java. The two samples were analyzed its color and chemical composition includes moisture content, ash content, fat content, protein content, and carbohydrate by difference which was the first stage in this research. Furthermore, the two samples were extracted by the multistage maceration method using water, 50% ethanol, ethyl acetate, and n-hexane as solvent, and the percentage yield was calculated. The second stage was the characterization of the picung crude seed extracts includes antifungal activity test by the agar dilution method and qualitative phytochemical screening. The third stage includes toxicity test to determine the LC50 value using the BSLT method, fractionation of the antifungal active compounds by ultrafiltration, and re-testing the antifungal activity of the ultrafiltration fraction by the agar dilution method. This stage was carried out on crude extract of old and fermented picung seeds which had the best inhibitory activity against A. flavus which defined by the lowest minimum inhibitory concentration (MIC). The fourth stage is identification and characterization of the selected ultrafiltration fraction using LC-MS/MS to obtain information on the active compouds that provide antifungal activity. This research found that the water-extract showed the best activity to suppress the germination of A. flavus spores, determined by the agar dilution method, with the MIC of 12,5 and 25 mg/mL for old and fermented seed, respectively. These water-extracts were then fractionated using 3 kDa molecular weight cut-off (MWCO) ultrafiltration membrane which resulted in two fractions, i.e. fraction with molecular weight (MW) of <3kDa and >3kDa. The fraction with MW <3kDa showed the best antifungal activity with the MIC values of 6,25 and 12,5 mg/mL for old and fermented seed, respectively. These fractionated water-extracts showed stronger antifungal activity than the unfractionated water-extract which was indicated by the lower MIC. The water-extracts of old and fermented picung seed were also analyzed its toxicity and showed a moderate toxicity with LC50 of 100–500 μg/mL, determined by the brine-shrimp lethality test. LC-MS/MS profile showed that fatty acid, amino acid, glycoside, and peptide were found as major compounds in the water-extract. The multivariate analysis, however, suggested that fatty acid and glycoside are responsible (VIP > 1 and r > 0,90) to the antifungal activity of water-extract of old and fermented picung seed.