Pengeditan Gen PCNA dengan Teknologi CRISPR/Cas9 untuk Ketahanan Terhadap Penyakit Kuning Keriting pada Cabai Besar.

Abstract

Penyakit virus kuning yang disebabkan oleh Pepper yellow leaf curl virus (PepYLCIV) dari kelompok Geminivirus bertanggung jawab pada kehilangan hasil pada produksi cabai merah di seluruh dunia. Pengendalian penyakit ini dengan pemuliaan tradisional sampai saat ini belum berhasil. Sumber gen untuk ketahanan terhadap penyakit ini belum ditemukan pada plasma nutfah. Gen PCNA diketahui mempunyai interaksi positif dengan proses replikasi geminivirus pada tanaman cabai. Inaktivasi gen PCNA tersebut dapat digunakan untuk menghasilkan tanaman cabai yang tahan geminivirus. Tujuan penelitian adalah untuk melakukan pengeditan gen PCNA menggunakan teknologi CRISPR/Cas9 untuk ketahanan terhadap penyakit keriting kuning (geminivirus) pada cabai besar. Strategi kloning Golden Gate digunakan untuk mengkonstruksi kaset CRISPR/Cas9 yang membawa RNA penuntun gen PCNA. Tanaman cabai merah ditransformasi dengan konstruk plasmid CRISPR/Cas9-gRNA PCNA melalui metode in planta menggunakan Agrobacterium tumefaciens EHA105. Galur-galur transforman dibioasai dengan inokulasi geminivirus dan dikonfirmasi menggunakan PCR dan sekuensing DNA untuk mengidentifikasi terjadinya mutasi pada gen PCNA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kaset plasmid CRISPR/Cas9 yang membawa RNA penuntun gen PCNA untuk pengeditan gen telah berhasil dikonstruksi. Transformasi genetik secara in planta menggunakan suspensi A. tumefaciens yang mengandung kaset CRISPR/Cas9-gPCNA telah menghasilkan masing-masing 307 dan 193 tanaman transforman dari varietas Lingga dan Ciko. Efikasi terhadap geminivirus telah diperoleh 6 dan 14 galur tanaman masing-masing dari varietas Lingga dan Ciko yang tahan terhadap geminivirus (tidak menunjukkan gejala). Hasil analisis sekuen DNA mengindikasikan bahwa galur cabai varietas Ciko dan Lingga telah mengalami mutasi pada gen PCNA dengan tipe mutasi insersi atau delesi satu basa. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pengeditan genom CRISPR/Cas9 dapat digunakan untuk mutagenesis gen target pada cabai merah.