Deteksi bakteri patogen dan fermentatif dari pangan menggunakan real-time polymerase chain reaction

Abstract

Penelitian ini bertujuan mengembangkan metode deteksi bakteri patogen Cronobacter sakazakii, Staphylococcus aureus dan bakteri fermentatif Lactobacillus plantarum menggunakan real-time PCR (rt-PCR). Amplifikasi sekuens parsial gen 16S rRNA dengan menggunakan PCR konvensional dan primer spesifik 16 SUNI-L/Saka-2b menghasilkan amplikon sebesar 1000 bp. Protokol rt-PCR dapat digunakan untuk mendeteksi tiga isolat Cronobacter sakazakii mulai siklus ke-4 sampai ke-30. Protokol ini menunjukkan spesifitas yang baik dengan kemampuan membedakan antara C. sakazakii dan C. muytjensii dengan suhu puncak pelelehan (Tm) sebesar 85,085,5 oC. Analisis L.plantarum menggunakan rt-PCR dengan primer 1541R/9F dan L.plantarum sa28k sebagai kultur standar, berhasil mengamplifikasi isolat L.plantarum sa28k dan beberapa isolat Lactobacillus sp. dengan kondisi sesuai PCR konvensional. Protokol yang digunakan dapat mendeteksi spesies L.plantarum sa28k dan mengidentifikasi beberapa isolat Lactobacillus sp. ditandai dengan suhu pelelehan yang hampir sama yaitu 85,5 oC. Isolasi DNA S. aureus juga berhasil dilakukan dengan metode yang dikembangkan yang ditunjukkan dengan pita DNA pada hasil elektroforesis isolat DNA. Amplifikasi dengan primer 63F dan 1387R menghasilkan produk PCR berukuran 1350 bp, sedangkan amplifikasi dengan primer 16sF dan 16sR3 menghasilkan produk PCR berukuran 240 bp. Suhu pelelehan (Tm) gen penyandi 16S rRNA S.aureus yang diamplifikasi baik dengan primer 63F/1387R maupun 16sF/16sR3 menggunakan rtPCR berkisar antara 83–84,5 °C. Protokol rt-PCR yang dikembangkan mempunyai spesifisitas yang baik dan dapat digunakan untuk mendeteksi bakteri uji.

Protocol of detection method using real time PCR (rt-PCR) was developed for Cronobacter sakazakii, Staphylococcus aureus and Lactobacillus plantarum. Amplification of partial sequencing of 16S rRNA using conventional PCR and specific primer of 16 SUNI-L/Saka-2b resulted in 1000 bp amplicon. The rt-PCR protocol could be used to detect three isolates of Cronobacter sakazakii began at cycle 4 until cycle 30. This protocol showed good specificity with the ability to differentiate between C. sakazakii and C. muytjensii with the peak of melting temperatures (Tm) were at 85,085,5 oC. Analysis of L.plantarum using rt-PCR with 1541R/9F primer and L.plantarum sa28k as standard culture successfully amplified L.plantarum sa28k isolate and several isolates of Lactobacillus sp. under PCR conventional condition. The protocol could be able to detect L.plantarum sa28k species and identify several Lactobacillus sp. isolates indicated by the similar melting temperature at 85.5 oC. Isolation of S. aureus DNA was also succesfully performed by the developed protocol represented by the DNA bands obtained from electrophoresis of the DNA isolate. Amplification using 63F and 1387R pimers produced 1350 bp PCR product, while 16sF dan 16sR3 primers produced 240 bp PCR product. Melting temperatures of the encoded gene of 16S rRNA S.aureus amplified either by 63F/1387R or 16sF/16sR3 primers using rtPCR ranged between 83–84,5 °C. The developed protocol had good specificity and can be used to detect the test bacteria using rt-PCR.