Pemilihan Metode Ekstraksi DNA dan Protokol Deteksistaphylococcus Aureus Menggunakan Real-Time PCR

Abstract

S. aureussering ditemukan pada pangan olahan sebagai penyebab keracunan pangan di Indonesia. Pada penelitian ini dilakukan deteksi bakteri S. aureus menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) yang memungkinkan Dilakukannya kuantifikasi DNA. Kultur yang digunakan adalah S. aureusA TeC 25934 dan tiga isolat S. aureuslokal yang berasal dari pangan siap saji. Ekstraksi DNA S. aureus dilakukan dengan 2 metode yaitu modifikasi metode Doyle&Doyle dan metode Mason. Pada metode Doyle&Doyle,Sodium Oodecyl Sulphate(SDS) ditambahkan pada suspensi pelet kultur bersamaan dengan lisozim kemudian diinkubasi dan tanpa penambahan Cethyiltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB). Pada metode Mason yang dimodifikasi, SDS ditambahkan sesudah inkubasi dengan penambahan lisozim dan ditambahkan eTAB sesudah diinkubasi dengan proteinase-K. Primer yang digunakan adalah sekuenspenyandi gen 16S rRNAyaitu63F/1387R dan 63sF/63sR3.Pengujian dengan Rea/-Time PCR dilakukan dengan 2 protocol modifikasi metode Lee, baik untuk tahap pre-PCR, denaturasi, penempelan primer, elongasi, dan post-PCR,maupun tahap pelelehan.Siklus yang digunakan adalah sebanyak 35 siklus.Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstraksi DNA dengan metode Mason yang Dimodifikasi dapat menghasilkan pita DNA yang lebih tajam dan jelas,dibandingkan dengan metode modifikasi dari Doyle&Doyle, setelah dilakukan gel elektroforesis. Ektsrak DNA cukup baik kemurniannya yang ditunjukkan dengan nilai perbandingan absorbansi pada A260nm/280nm yaitu sebesar 1,8-2,2. Kondisi protokol 2 dengan 35 siklus dapat menunjukkan suhu puncak kurva pelelehan dengan lebih baik dibandingkan protokol 1. Isolat lokal yang diuji mempunyai suhu puncak pelelehan yang sama dengan S. aureusATCC 25934 yaitu 84°C jika diuji dengan primer 63F/1387R. Ketika diuji dengan primer 63sF/63sR3, isolat SJ1 menunjukkan kesamaan suhu puncak pelelehan dengan kultur acuan, yaitu 83,75°C. Hal ini menunjukkan bahwa protokol yang dikembangkan dapat digunakan untuk mengidentifikasi isolat S. aureus berdasarkan sekuens 16S rRNA kultur referensi. Selanjutnya perlu dilakukan pengembangan protokol untuk kuantifikasi dan uji spesifisitas protokol yang dikembangkan