Optimalisasi Isolasi DNA Genom Tanaman Obat Menggunakan Metode CTAB Tanpa Nitrogen Cair

Abstract

Penggunaan nitrogen cair pada proses isolasi DNA bertujuan untuk memecah dinding sel tanaman dan mempermudah penghancuran jaringan, sehingga DNA dapat diekstraksi secara optimal. Namun, nitrogen cair sering kali sulit diperoleh, terutama di lokasi terpencil atau laboratorium dengan fasilitas terbatas. Oleh karena itu, pengembangan metode isolasi DNA yang tidak memerlukan nitrogen cair menjadi alternatif yang lebih praktis dan ekonomis. Metode ini dilakukan dengan memfiksasi jaringan daun menggunakan berbagai larutan fiksasi sebelum proses ekstraksi DNA genom menggunakan metode CTAB, tanpa melibatkan nitrogen cair. Daun dari delapan jenis tanaman obat dikumpulkan dari daerah Tonk (kebun tanaman obat). Tanaman yang digunakan meliputi Azadirachta indica (A. Juss.), Ocimum sanctum (Linn.), Catharanthus roseus (Linn.), Chlorophytum borivilianum (Sant. F), Calotropis gigantea (Linn.), Syzygium cumini (Linn.), Zizyphus mauritiana (Lam.), dan Emblica officinalis (Linn.). Daun-daun tersebut kemudian diberi beberapa perlakuan fiksasi untuk keperluan isolasi DNA genom. Jaringan daun dicelupkan ke dalam larutan fiksasi selama 30 menit untuk mendenaturasi enzim, kemudian diinkubasi pada suhu ruang (37°C) dan suhu −80°C. Larutan fiksasi yang digunakan meliputi alkohol absolut, campuran alkohol–kloroform (70:30), serta alkohol–EDTA 0,5 M (pH 8,0) dengan perbandingan 70:30, masing-masing sebanyak 5 ml per gram jaringan. Setelah proses fiksasi, jaringan daun dihomogenisasi menggunakan mortar dan alu. Beberapa modifikasi diterapkan pada metode CTAB, antara lain variasi konsentrasi polyvinyl pyrrolidone (PVP) sebesar 1,5%, 2,0%, dan 2,5%, serta penambahan tahap ekstraksi menggunakan kloroform–isoamil alkohol (24:1) untuk meningkatkan efisiensi penghilangan senyawa pengganggu seperti polifenol dan polisakarida. DNA yang diperoleh kemudian didilusi hingga 1000 kali menggunakan buffer Tris-EDTA (pH 8,0). Analisis kuantitatif DNA dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 260 nm untuk DNA dan 280 nm untuk protein, dengan rasio A260/A280 digunakan sebagai indikator kemurnian DNA. ...