Biofilm Konsorsium Mikrob Saccharomyces cerevisiae dan Bacillus megaterium Penghasil Alkohol Dehidrogenase untuk Biosensor Etanol

Abstract

Penentuan kadar etanol merupakan aspek krusial dalam industri pangan dan minuman untuk menjamin kualitas, keamanan, serta kepatuhan terhadap regulasi, termasuk batas etanol <0,5% sesuai Fatwa MUI No. 10 Tahun 2018. Berbagai metode analitik konvensional seperti HPLC dan spektroskopi memiliki akurasi tinggi, namun cenderung mahal. Biosensor etanol berbasis enzim alkohol dehidrogenase (ADH) telah menunjukkan kinerja tinggi dengan batas deteksi rendah. Pendekatan berbasis mikroorganisme, khususnya konsorsium S. cerevisiae dan B. megaterium sebagai penghasil ADH menawarkan keunggulan dalam rentang deteksi yang lebih luas karena perbedaan sensitivitas masing-masing mikrob terhadap konsentrasi etanol. Penelitian sebelumnya menunjukkan biosensor konsorsium mikrob mampu mendeteksi etanol pada rentang 0,2–6% dengan stabilitas 80% selama 7 minggu, namun rentang tersebut masih terbatas. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan mengembangkan biosensor etanol berbasis konsorsium mikrob dengan rentang deteksi yang lebih luas serta linearitas dan stabilitas tinggi yang setara dengan kinerja enzim ADH. Metode secara umum yang dilakukan di antaranya penanaman isolat bakteri penghasil enzim alkohol dehidrogenase (ADH), yaitu B. megaterium dan S. cerevisiae untuk diperoleh kultur mikrob secara murni, lalu dilakukan optimasi pembentukkan biofilm yang terdiri atas waktu inkubasi, volume konsorsium, dan nilai absorbansi mikrob. Biofilm yang sudah dilakukan optimasi dibuat untuk imobilisasi di permukaan elektrode screen printed carbon electrode (SPCE). Biofilm konsorsium mikrob diaplikasikan pada pengujian kadar etanol konsentrasi 0,2–10% menggunakan metode voltametri siklik untuk dilihat arus oksidasi yang dihasilkan. Pengujian aktivasi enzim murni ADH pada konsentrasi 3×10-6 CFU/mL juga dilakukan untuk membandingkan kinerja pada biosensor etanol berbasis konsorsium mikrob dengan enzim murni ADH. Hasil penelitian menunjukkan konsorsium mikrob S. cerevisiae dan B. megaterium memiliki pertumbuhan optimal pada nilai absorbansi OD595 sebesar 0,7 yang menandai fase mid logaritmik pada pembentukan biofilm. Kondisi optimum biofilm dicapai pada pH 7, masa inkubasi selama 10 hari, dan rasio inokulum 1:1 dengan volume 100 µL. Biosensor etanol berbasi konsorsium mikrob yang dikembangkan menunjukkan performa analitik yang baik dengan respon linear pada kisaran 0,2–10% (R² = 0,9926), limit deteksi (LOD) sebesar 0,0624% dan limit kuantifikasi (LOQ) sebesar 0,2079% , dimana konsentrasi terendah etanol yang masih dapat terukur secara akurat dan presisi sebesar 0,2079%, akurasi hasil pengukuran sebesar 82,50-112,20%, serta stabilitas operasional sebesar 80% selama 10 minggu pada suhu ruang.

Determination of ethanol content is a crucial aspect in the food and beverage industry to ensure product quality, safety, and regulatory compliance, including the ethanol limit of <0.5% as stipulated in Fatwa MUI No. 10 of 2018. Various conventional analytical methods, such as high-performance liquid chromatography (HPLC) and spectroscopy, provide high accuracy but are generally costly. Ethanol biosensors based on alcohol dehydrogenase (ADH) enzymes have demonstrated high performance with low detection limits. Microorganism based approaches, particularly consortia of S. cerevisiae and B. megaterium, offer advantages in achieving a wider detection range due to differences in microbial sensitivity to ethanol concentrations. Previous studies reported that microbial consortium biosensors were able to detect ethanol in the range of 0.2–6% with 80% stability over 7 weeks, although this detection range remains limited. Therefore, this study aims to develop a microbial consortium based ethanol biosensor with a broader detection range, as well as high linearity and stability comparable to those of ADH enzyme based biosensors. The methods employed included the cultivation of ADH producing microbial isolates, namely B. megaterium and S. cerevisiae, to obtain pure cultures, followed by optimization of biofilm formation parameters, including incubation time, consortium volume, and microbial absorbance values. The optimized biofilm was immobilized on the surface of a screen-printed carbon electrode (SPCE). The microbial consortium biofilm was applied for ethanol concentration measurements in the range of 0.2–10% using cyclic voltammetry to evaluate the resulting oxidation current. In addition, activation tests using pure ADH enzyme at a concentration of 3×10?6 CFU/mL were conducted to compare the performance of the microbial consortium based ethanol biosensor with that of the pure ADH enzyme based biosensor. The results demonstrated that the S. cerevisiae and B. megaterium consortium exhibited optimal growth at an absorbance value of OD595 = 0.7, indicating the mid-logarithmic phase during biofilm formation. Optimal biofilm conditions were achieved at pH 7, an incubation period of 10 days, and a 1:1 inoculum ratio with a volume of 100 µL, resulting in a detection range of 0.2– 10%. The developed microbial consortium based ethanol biosensor exhibited good analytical performance, with high linearity (R² = 0.9926), a limit of detection (LOD) of 0.0624%, and a limit of quantification (LOQ) of 0.2079%, where the lowest ethanol concentration that could still be measured accurately and precisely was 0.2078. The measurement accuracy ranged from 82.50% to 112.20%, and the operational stability reached 80% over 10 weeks at room temperature.