Enhanced catalytic activity of a truncated Lipase/Phospholipase from Aurantiochytrium sp. MG91

Abstract

Thraustochytrids are a group of non-photosynthetic, heterotrophic, fungus-like unicellular eukaryotes that can secrete hydrolytic enzymes such as Lipase/Phospholipase. Lipase/Phospholipase (Lip/Plip) from thraustochytrids is a bifunctional enzyme capable of hydrolyzing lipid and phospholipid. Unlike typical microbial lipases, it contains a unique 150 amino acid residue in the N-terminal domain of unknown function. The residual amino acids at the C- or N-terminal are the most versatile regions of protein structure. This region is typically less conserved than the catalytic domain. Protein engineering through the truncation of the C- or N-terminals may impact the protein's robustness and flexibility. Those alterations will affect the protein's biological activity and biochemical characteristics. As a result, N-truncation of the unidentified Lip/Plip domain may indicate whether it is necessary or not for catalysis. We hypothesized that the 150 amino acid residues in the N-terminal domain is an enzyme accessory that could act as an anchor, signal peptide, or support during folding. The thraustochytrid MG91 isolate, which was successfully isolated from mangrove waters in Muara Gembong, Bekasi, Indonesia, has been demonstrated to accumulate lipids up to 40–50% of dry cell weight (DCW). This study assessed the activity and substrate specificity of the full-length (L-420) and truncated (S-270) Lip/plip MG91 expressed heterologously in Escherichia coli to reveal the function of unidentified domains on catalysis. In addition, an in-depth bioinformatic analysis of the protein's 3-D structure was carried out to predict and understand the structure-function link that results from N-terminal truncation. Hence, this study aimed to compare the activity, substrate specificity, and predict the 3D structure of L-420 and S-270. The MG91 isolate was first identified morphologically and molecularly based on the gene encoding 18S rRNA analysis. The MG91 isolates cultivated in GYP broth media turned the color of the media turbid and developed settling grains at the bottom of the flask. Meanwhile, on a GYP agar medium, the colonies were circular, opaque, not slimy, with entire margins, a convex elevation, a smooth colony surface, and pale green colonies. Based on the gene encoding 18S rRNA analysis (±700 bp), MG91 was identified as closely related to Aurantiochytrium limacinum and A. mangrovei. The full-length (L-420) and truncated (S-270) lip/plip were successfully amplified, with a size of ±1,260 bp and ±813 bp, respectively. The L-420 and S-270 lip/plip were cloned and expressed heterologously in E. coli. Each clone (L-420 and S-270) obtained was then evaluated on an LA medium enriched with tributyrin (TBN). Upon 18 hours of incubation, L-420 and S-270 clones produced greater clear zones in contrast to E. coli harboring pET28a(+). SDS-PAGE analysis revealed that L-420 and S-270 Lip/Plip expressed in E. coli had molecular weights of ~46.5 kDa and ~30 kDa, respectively. The lipolytic activity of recombinant proteins was also qualitatively evaluated using zymography. In this investigation, either L-420 or S-270 formed degradation zones on the overlaid agar that parallel with native PAGE electrophoresis bands. The S-270 exhibited an unchanged trend in substrate specificity compared to L-420. Specific lipase activity showed the highest and optimum on the p-nitrophenyl laurate (C12) substrate in both L-420 and S-270, with 14.65 U/mg and 37.46 U/mg, respectively. The S-270 exhibited enhanced specific lipase activity on all evaluated pNP-Ester substrates, 4–6-fold higher than L-420. On the other hand, S-270 specific phospholipase activity also outperformed L-420 in both sunflower- and soy-derived phosphatidylcholine by 1.4-fold. The 3D protein model structure of L-420 and S-270 were predicted with SWISS-Model and AlphaFold2 MMseqs2. The L-420 and S-270 have globular forms, but L-402 contains a domain extension at the N-terminal. The pentapeptide G-Y-S-R-G is identified in the catalytic domain positioned at the elbow of the a12 base chain (311-313) and the ß6 end (309-310), with a predicted position catalytic triad consisting of Ser311, Asp368, and His382. Based on superimposition, the predicted structure of S-270 has no significant differences in structural changes observed. Additionally, we annotated the N-terminal end of the Lip/Plip MG91, indicating the presence of amino acids that are expected to behave as amino acids embedded in the membrane. The phylogenetic tree demonstrates that Lip/Plip MG91 is most closely related to Y- and GX-types that share the conserved pentapeptide G-X-S-X-G, even though the X1 and X2 residues differ between the closest species. Based on our significant findings, we attempt to explain the S-270 increased catalytic activity compared to L-420. The most probable rationale is that the smaller protein size makes the S-270 protein easier to express because the genetic and metabolic burden on the host is reduced. The smaller size causes a conformational shift, altering interfacial contact with the substrate, allowing for more flexible substrate-protein interactions. The protein's remaining function upon truncation suggests that the region possesses no direct effect on protein activity. This is the first report demonstrating that truncation of the N-terminal domain in Lip/Plip from thraustochytrids can enhance its catalytic activity, suggesting potential applications in lipid biotechnology.

Thraustochytrids merupakan kelompok cendawan semu yang memiliki karakteristik uniselular, tidak berfotosintesis, dan heterotrof. Kelompok ini mampu menyekresikan enzim hidrolitik seperti Lipase/Fosfolipase. Lipase/Fosfolipase (Lip/Plip) dari thraustochytrids merupakan enzim dengan fungsi ganda yang mampu menghidrolisis lipid dan fosfolipid. Berbeda dari lipase mikroba lainnya, Lip/Plip memiliki 150 residu asam amino pada bagian N-terminal dengan fungsi yang belum diketahui. Residu asam amino pada C- atau N-terminal merupakan daerah paling fleksibel dalam struktur protein. Domain tersebut umumnya bersifat tidak terkonservasi dibanding dengan domain katalitik. Rekayasa protein melalui pemotongan C- atau N-terminal dimungkinkan akan memengaruhi stabilitas dan fleksibilitas protein. Alterasi tersebut dimungkinkan akan berdampak terhadap aktivitas biologis dan karakteristik biokimia protein. Oleh sebab itu, pemotongan N-terminal dari unidentified domain dimungkinkan akan mengindikasikan peranan daerah tersebut bersifat esensial atau tidak dalam proses katalisis. Penelitian ini menghipotesiskan bahwa 150 residu asam amino pada N-terminal merupakan aksesoris enzim yang mungkin berperan sebagai jangkar, sinyal peptida, atau membantu dalam proses pelipatan. Isolat thraustochytrids MG91 yang berhasil diisolasi dari perairan mangrove di Muara Gembong, Bekasi, Indonesia diketahui memiliki kemampuan untuk mengakumulasikan lipid mencapai 40–50% dari berat kering selnya. Pada penelitian ini, aktivitas dan spesifisitas substrat enzim Lip/Plip MG91 full-length (L-420) dan truncated (S-270) yang diekspresikan secara heterolog di Escherichia coli dievaluasi untuk mengungkap fungsi dari unidentified domain terhadap aktivitas katalitik. Selain itu, analisis bioinformatika dari struktur 3D protein dilakukan untuk memprediksi dan mengidentifikasi hubungan struktur dengan fungsi yang didapatkan dari hasil pemotongan N-terminal domain. Oleh sebab itu, penelitian ini bertujuan untuk membandingkan aktivitas enzim, spesifisitas substrat, dan memprediksi struktur 3D protein antara L-420 dan S-270. Isolat MG91 diidentifikasi secara morfologi dan molekuler berbasis analisis sekuen gen penyandi 18S rRNA. Isolat MG91 yang dikultur pada media GYP cair memiliki pola pertumbuhan yang menyebabkan kekeruhan dan membentuk endapan berpasir pada dasar tabung. Sementara itu, pada media GYP agar, koloni berbentuk bulat, opaque, tidak berlendir, tepi entire, elevasi cembung, permukaan koloni halus, dan berwarna hijau pucat. Berdasarkan analisis sekuen gen penyandi 18S rRNA (±700 pb), MG91 berkerabat dekat dengan Aurantiochytrium limacinum dan A. mangrovei. Gen penyandi Lip/Plip L-420 dan S-270 berhasil diamplifikasi dengan ukuran ±1.260 pb dan ±813 pb, secara berurut. Gen penyandi Lip/Plip L-420 dan S-270 berhasil diklon dan diekspresikan secara heterolog di E. coli. Masing-masing klon (L-420 dan S-270) yang didapatkan dievaluasi pada media LA yang disuplementasi dengan tributyrin (TBN). Setelah diinkubasi selama 18 jam, klon L-420 dan S-270 menghasilkan zona bening lebih besar dibandingakn E. coli-pET28a(+). Analisis SDS-PAGE mengungkapkan bahwa L-420 dan S-270 yang diekspresikan di E. coli memiliki berat molekul sebesar ~46.5 kDa dan ~30 kDa, secara berurut. Aktivitas lipolitik dari protein rekombinan juga dievaluasi secara kualitatif menggunakan zymogram. Hasil zymogram menunjukkan bahwa L-420 dan S-270 mampu membentuk zona degradasi pada agar overlaid yang paralel dengan pita hasil Native-PAGE. S-270 tidak menunjukkan perubahan tren spesifisitas substrat dibandingkan dengan L-420. Aktivitas spesifik memperlihatkan bahwa L-420 dan S-270 memiliki aktivitas tertinggi dan optimal pada substrat p-nitrophenyl laurate (C12) dengan nilai 14,65 U/mg dan 37,46 U/mg, secara berurut. S-270 menunjukkan peningkatan aktivitas spesifik lipase pada semua substrat pNP-Ester yang dievaluasi hingga 4–6 kali lipat lebih tinggi dibanding L-420. Selain itu, aktivitas spesifik fosfolipase S-270 juga lebih tinggi dari L-420 pada substrat fosfatidilkolin yang berasal dari bunga matahari dan kedelai sebesar 1,4 kali lipat. Struktur model protein 3D dari L-420 dan S-270 diprediksi dengan SWISS-Model dan AlphaFold2 MMseqs2. L-420 dan S-270 memiliki bentuk globular, tetapi L-402 memiliki ekstensi domain pada N-terminal. Pentapeptida G-Y-S-R-G teridentifikasi pada domain katalitik dengan posisi siku antara pangkal rantai a12 (311-313) dan ujung ß6 (309-310), dengan prediksi posisi katalitik triad yang terdiri atas Ser311, Asp368, dan His382. Berdasarkan superimposisi, prediksi stuktur S-270 tidak memiliki perbedaan yang signifikan terhadap L-420. Selain itu, pada N-terminal dari Lip/Plip MG91, teranotasi adanya asam amino yang dimungkinkan berperan sebagai asam amino yang tertanam dalam membran. Pohon filogenetik menunjukkan bahwa Lip/Plip MG91 paling dekat pengelompokkannya dengan tipe Y dan GX yang memiliki pentapeptida G-X-S-X-G, meskipun residu X1 dan X2 berbeda di antara spesies terdekat yang dibandingkan. Berdasarkan temuan utama pada penelitian ini, aktivitas katalitik S-270 mengalami peningkatan dibandingkan dengan L-420. Secara umum, alasan yang paling mungkin yaitu ukuran S-270 yang lebih kecil membuat lebih mudah diekspresikan karena beban genetik dan metabolisme pada inang berkurang. Ukuran yang lebih kecil juga menyebabkan perubahan konformasi, memengaruhi kontak interfasial dengan substrat yang memungkinkan interaksi substrat-protein lebih fleksibel. Aktivitas katalisis enzim yang tetap ada bahkan meningkat setelah pemotongan, menunjukkan bahwa domain tersebut tidak memiliki efek langsung pada aktivitas protein. Penelitian ini merupakan laporan pertama kloning dan ekspresi Lip/Plip dari thraustochytrids yang menunjukkan bahwa pemotongan domain N-terminal meningkatkan aktivitas katalitik Lip/Plip dan berpotensi untuk diaplikasikan dalam bioteknologi lipid.