Variasi Genetik Lebah Madu Apis cerana Fabricius, 1793 (Hymenoptera: Apidae) di Kalimantan Berdasarkan Sekuen Mitokondria COI, COII, dan IGS COI/COII

Abstract

DNA mitokondria (DNAmt) mempelihatkan tingkat mutasi yang tinggi sehingga digunakan untuk menyelidiki genetika populasi dan evolusi. Gen cytochrome c oxidase 1 (COI) adalah salah satu gen di DNAmt yang digunakan sebagai sekuen DNA standar untuk identifikasi hewan pada tingkat spesies. Selain itu gen COI juga telah digunakan untuk mendeteksi variasi DNA intraspesies pada hewan, termasuk pada lebah madu Asia Apis cerana Fabricius, 1793 (Hymenoptera: Apidae). Berdasarkan DNAmt gen COI, populasi A. cerana di Paparan Sunda terbagi menjadi garis keturunan Indo-Malaya dan Indonesia. Selain gen COI, studi populasi A. cerana juga telah dilakukan menggunakan DNAmt gen cytochrome c oxidase 2 (COII) dan non-coding intergenic spacer (IGS) COI/COII di Pulau Jawa dan Sumatra. Kedua sekuen menunjukkan terpisahnya populasi A. cerana dari kedua pulau tersebut. Penelitian berbasis gen COI A. cerana di empat provinsi Kalimantan menemukan koloni dengan haplotipe Jawa di Kalimantan Selatan dan Tengah. Oleh karena itu, tujuan utama penelitian ini adalah untuk menganalisis variasi genetik A. cerana menggunakan sekuen DNAmt COI, COII, dan IGS pada seluruh lima provinsi di Kalimantan dan menganalisis kekerabatan A. cerana di Kalimantan dengan lebah ini di Asia berdasarkan data GenBank. Koleksi sampel A. cerana dilakukan oleh tim Prof. Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si. bersama lima mitra dosen dari empat universitas di Kalimantan. Sebanyak 29 koloni A. cerana dikoleksi dari 12 kecamatan di lima provinsi di Kalimantan, yang merupakan bagian dari Pulau Borneo atau disebut juga Pulau Kalimantan. Tahap ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan protokol DNA Mini Kit GenAid. Amplifikasi DNA dilakukan dengan PCR, dan sequencing amplikon PCR dilakukan di 1st BASE, Selangor, Malaysia. Analisis sekuen DNA dilakukan dengan BLASTN, Clustal X 2.1, DNAsp 5.10, Network 10.2, dan MEGA11. Hasil sekuen COI, COII, dan IGS berturut-turut adalah 645, 474, dan 88 pb dan telah didaftarkan pada GenBank dengan Accession Number COI LC788820 - LC788877 dan IGS-COII LC788878 - LC788935. Analisis BLASTN gen COI menunjukkan bahwa terdapat dua kelompok lebah A. cerana di Kalimantan dengan persentase hampir sama yaitu 48 dan 52 %. Kelompok pertama dan kedua A. cerana Kalimantan tersebut homolog tingkat similarity > 98% berturut-turut dengan A. cerana asal Sabah, Borneo (AP018149) dan A. cerana asal Jawa (LC596969, LC596978 dan LC461196). Variasi nukleotida A. cerana ditemukan dengan total 28, 26, dan tujuh variasi untuk sekuen COI, COII, dan IGS. Variasi tersebut menghasilkan 10, sembilan, dan tujuh haplotipe untuk ketiga sekuen. Sejumlah 14 dari 29 (48%) koloni A. cerana di Kalimantan terdeteksi sebagai haplotipe native Borneo yaitu garis keturunan Indo-Malaya, yang sesuai dengan hasil BLAST. Penelitian ini mengungkap empat, tiga, dan dua haplotipe untuk COI, COII, dan IGS pada A. cerana garis keturunan Indo-Malaya di Kalimantan. Haplotipe 2

Borneo1 pada ketiga sekuen adalah haplotipe umum dalam garis keturunan Indo- Malaya di Kalimantan yang sesuai dengan temuan 20 tahun yang lalu pada gen COI. Haplotipe baru COI-Kalimantan8, Kalimantan Timur, memiliki variasi spesifik pada posisi nukleotida 85 (G ? A). Haplotipe baru COII adalah haplotipe Kalimantan4, Kalimantan Timur, dengan variasi spesifik pada posisi nukleotida 202 (A ? G), dan haplotipe Kalimantan5, Kalimantan Selatan, yang memiliki variasi spesifik pada posisi 150 dan 203 (T ? C). Variasi spesifik ini berpotensi menjadi penanda molekuler A. cerana garis keturunan Indo-Malaya dari Kalimantan Timur dan Selatan di antara seluruh populasi Asia. Lebah madu A. cerana di Kalimantan memiliki 52% garis keturunan Indonesia yang merupakan haplotipe Jawa berdasarkan hasil penelitian sebelumnya. Hasil analisis morfometrika geometris venasi sayap A. cerana pada koloni yang sama dengan penelitian ini juga menunjukkan bahwa populasi A. cerana asal Kalimantan memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan populasi Jawa. Fenomena ini kemungkinan disebabkan oleh dampak antropogenik yang memindahkan A. cerana dari Jawa ke Kalimantan. Enam haplotipe Jawa ditemukan untuk masing-masing gen COI dan COII, serta lima untuk IGS. Berdasarkan gen COI dan COII, A. cerana di Kalimantan Timur memiliki keragaman genetik tertinggi, sedangkan untuk IGS, keragaman genetik tertinggi terdapat di Kalimantan Selatan. Hasil ini paralel dengan perbedaan genetik pada semua sekuen yang menunjukkan nilai fixation index yang rendah antara populasi Kalimantan Timur dan Selatan. Hal ini menunjukkan bahwa populasi A. cerana pada kedua provinsi tersebut cenderung mirip. Fenomena ini mungkin karena banyak haplotipe Jawa A. cerana yang ditemukan di Kalimantan Timur dan Selatan. Jarak genetik tertinggi A. cerana dari lima provinsi di Kalimantan berdasarkan sekuens COI, COII, IGS, dan gabungan COI-IGS-COII berturut-turut adalah 4,08%, 5,92%, 6,27%, dan 4,79%. Angka yang relatif tinggi ini disebabkan oleh keberadaan 52% sampel yang merupakan haplotipe Jawa. Pada A. cerana garis keturunan Indo-Malaya di Kalimantan, jarak genetik tertinggi COI, COII, IGS, dan gabungan COI-IGS-COII adalah 0,58%, 0,66%, 1,18%, dan 0,47%. Median-joining network dan konstruksi pohon filogenetik dari ketiga sekuen menunjukkan populasi A. cerana di Paparan Sunda membentuk dua garis keturunan. Garis keturunan Indo-Malaya terdiri dari koloni A. cerana dari Pulau Borneo termasuk wilayah Kalimantan, serta dari Sumatra dan Selangor, Malaysia. Garis keturunan Indonesia meliputi koloni dari wilayah Kalimantan, Jawa, Sunda Kecil, Sumatra Utara, Belitung, serta wilayah non-native yaitu Sulawesi, Ambon, dan Manokwari. Pohon filogenetik yang dibentuk berdasarkan gen COI memisahkan A. cerana garis keturunan Indo-Malaya dari Borneo dan Sumatra. Penelitian ini telah berhasil menyusun database dan menunjukkan bahwa penggunaan sekuen DNAmt, COI, COII, atau IGS dapat mengungkap asal A. cerana pada populasi di Paparan Sunda, khususnya di Kalimantan. Hasil penelitian ini dapat menjadi bahan pertimbangan kebijakan transfer lebah madu A. cerana di Kalimantan dan Indonesia. Penelitian selanjutnya diharapkan dapat melakukan analisis molekuler dari DNA mitokondria utuh untuk mendukung penemuan dari penelitian ini dan mendapatkan hasil yang lebih menyeluruh.

Mitochondrial DNA (mtDNA) shows a high mutation rate, which is suitable as the marker for population genetics and evolution. The cytochrome c oxidase 1 (COI) gene is one of the mtDNA genes used as a standard DNA sequence for animal identification at the species level. Furthermore, the COI gene has also been used to detect intraspecies DNA variation in animals, including the Asian honey bee Apis cerana Fabricius, 1793 (Hymenoptera: Apidae). Based on the mtDNA COI gene, the A. cerana population in the Sundaland is divided into the Indo-Malayan and Indonesian lineages. In addition to the COI gene, population studies of A. cerana have also been conducted using the mtDNA cytochrome c oxidase 2 (COII) gene and the non-coding intergenic spacer (IGS) COI/COII in Java and Sumatra. Both sequences indicate the separation of A. cerana populations from the two islands. A study based on the COI gene of A. cerana in Kalimantan found colonies with Java haplotypes in South and Central Kalimantan. Therefore, the main objective of this study was to analyze further the genetic variation of A. cerana using mtDNA COI, COII, and IGS sequences in all five provinces in Kalimantan and to analyze the relationship of A. cerana in Kalimantan with this bee in Asia based on GenBank data. Sample collection of A. cerana was carried out by Prof. Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Sc. team, with five counterparts from four universities in Kalimantan. A total of 29 A. cerana colonies were collected from 12 districts in five provinces in Kalimantan, which is part of Borneo Island or also called Kalimantan Island. The DNA extraction used GenAid DNA Mini Kit. DNA amplification was carried out by PCR, and PCR amplicon sequencing was carried out at 1st BASE, Selangor, Malaysia. DNA sequence analysis was done using BLASTN, Clustal X 2.1, DNAsp 5.10, Network 10.2, and MEGA11. The COI, COII, and IGS sequences are 645, 474, and 88 bp, respectively and have been registered in GenBank with Accession Numbers COI LC788820 - LC788877 and IGS-COII LC788878 - LC788935. BLASTN analysis of the COI gene shows two groups of A. cerana bees in Kalimantan with almost the same percentage, namely 48 and 52%. The first and second groups of A. cerana from Kalimantan are homologous with a similarity level of > 98%, respectively, with A. cerana from Sabah, Borneo (AP018149) and A. cerana from Java (LC596969, LC596978, and LC461196). Nucleotide variations of A. cerana were found with a total of 28, 26, and seven variations for the COI, COII, and IGS sequences, respectively. The variations resulted in 10, nine, and seven haplotypes for the three sequences. A total of 14 out of 29 (48%) A. cerana colonies in Kalimantan were detected as native Borneo haplotype, that is, Indo-Malayan lineage, which follows the BLAST results. This study revealed four, three, and two haplotypes for COI, COII, and IGS in the A. cerana Indo-Malayan lineage in Kalimantan. The Borneo1 haplotype in the three sequences is a common haplotype in the Indo-Malayan lineage in Kalimantan, which is in accordance with the findings 20 years ago in the COI gene. 4

The new haplotype COI-Kalimantan8, East Kalimantan, has a specific variation at nucleotide position 85 (G ? A). The new COII haplotypes are the Kalimantan4 haplotype, East Kalimantan, with a specific variation at nucleotide position 202 (A ? G), and the Kalimantan5 haplotype, South Kalimantan, which has a specific variation at positions 150 and 203 (T ? C). These specific variations can potentially be molecular markers of the Indo-Malayan lineage of A. cerana from East and South Kalimantan among all Asian populations. Apis cerana honeybees in Kalimantan have 52% Indonesian lineages, which are Java haplotypes from previous studies. The results of geometric morphometric analysis of A. cerana wing venation in the same colony as this study also showed that the A. cerana population from Kalimantan has a close relationship with the Java population. This phenomenon is likely caused by the anthropogenic impact that moved A. cerana from Java to Kalimantan. Six Java haplotypes were found for each COI and COII gene, and five for IGS. Based on the COI and COII genes, A. cerana in East Kalimantan revealed the highest genetic diversity, while for IGS, the highest genetic diversity was found in South Kalimantan. This result was parallels with the genetic differences in all sequences that showed low fixation index values between the East and South Kalimantan populations. This result indicates that the A. cerana populations in the two provinces tend to be similar. This phenomenon may be due to the many Java haplotypes of A. cerana found in East and South Kalimantan. The highest genetic distances of A. cerana from five provinces in Kalimantan based on COI, COII, IGS, and combined COI-IGS-COII sequences were 4.08%, 5.92%, 6.27%, and 4.79%, respectively. This relatively high number is due to 52% of the sampel being a Java haplotype. In A. cerana Indo-Malayan lineage in Kalimantan, the highest genetic distances of COI, COII, IGS, and combined COI- IGS-COII were 0.58%, 0.66%, 1.18%, and 0.47%. Median-joining network and phylogenetic tree construction from the three sequences showed that the A. cerana population in the Sundaland formed two main lineages. The Indo-Malayan lineage consists of A. cerana colonies from Borneo Island, including the Kalimantan region, and A. cerana from Sumatra and Selangor, Malaysia. The Indonesian lineage includes A. cerana colonies from Kalimantan, Java, Lesser Sunda, North Sumatra, Belitung, and non-native regions, namely Sulawesi, Ambon, and Manokwari. The phylogenetic tree formed based on the COI gene separates the A. cerana Indo-Malayan lineage from Borneo and Sumatra, which is compatible with the morphocluster. This study has successfully compiled a database and demonstrated that mtDNA, COI, COII, or IGS sequences can reveal the origin of A. cerana in populations on the Sundaland, especially in Kalimantan. The results of current molecular data can be used for consideration in the transfer policy of A. cerana honey bees in Kalimantan and Indonesia. Further research is expected to conduct molecular analysis of complete mitochondrial DNA to support the findings of this study to obtain more comprehensive results.