Pemurnian Parsial, Karakterisasi, dan Deteksi Gen Penyandi Protease Lacticaseibacillus paracasei

Abstract

Enzim merupakan protein fungsional yang mampu mempercepat reaksi kimia dan menurunkan energi aktivasi. Aktivitas enzim pada proses biokimia terjadi melalui perubahan substrat menjadi produk. Penggunaan enzim semakin meningkat karena mempunyai efisiensi katalitik yang baik, spesifitas yang tinggi, dan ramah lingkungan dibandingkan dengan katalis sintetik. Enzim yang paling banyak digunakan hingga permintaannya mencapai 60 % dari permintaan pasar enzim ialah protease. Protease merupakan enzim yang berperan dalam hidrolisis ikatan peptida pada protein sehingga menghasilkan peptida atau asam amino. Protease pada industri pangan digunakan untuk mengempukkan daging, memperbaiki tekstur, mempersingkat waktu simpan, menjernihkan minuman, menggumpalkan susu, dan menghasilkan cita rasa. Protease pada industri nonpangan digunakan untuk produksi deterjen, pengolahan kulit, farmasi, pemulihan perak, dan bioremediasi. Mikroorganisme penghasil enzim protease, terutama bakteri, memiliki peran yang penting dalam aplikasi bidang industri. Hal ini disebabkan oleh bakteri dapat dikulturkan, menghasilkan yield yang tinggi, dan dapat direkayasa secara genetik. Protease yang diproduksi bakteri bersifat ekstraseluler sehingga secara langsung dapat disekresikan ke dalam kaldu fermentasi. Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri Gram positif yang telah banyak digunakan untuk fermentasi susu, serta pembuatan produk makanan dan minuman fermentasi. Industri pangan maupun nonpangan memanfaatkan BAL karena berstatus Generally Recognized as Safe (GRAS). Spesies BAL yang aktif sebagai proteolitik di antaranya Lactococcus salivarius, Lacticaseibacillus casei, dan Lactobacillus delbrueckii. Isolat BAL Lacticaseibacillus paracasei IN17 hasil isolasi pada penelitian sebelumnya memiliki aktivitas protease dengan kondisi optimum pada perlakuan statis, umur 18 jam, pH 7, suhu 30 °C, dan dihambat oleh ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Penelitian tersebut masih terbatas pada ekstrak kasar enzim tanpa dilakukan pemurnian. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan melakukan pemurnian parsial, karakterisasi, dan deteksi gen penyandi protease yang diproduksi oleh L. paracasei. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahapan, mulai dari analisis fisiologi dan analisis molekuler. Tahap penelitian diawali dengan peremajaan isolat, identifikasi isolat berdasarkan gen 16S rRNA, kemudian produksi protease pada kondisi kultur yang optimum. Kondisi tersebut yaitu diproduksi menggunakan susu skim dengan inkubasi kultur pada umur 18 jam secara statis. Protease ekstrak kasar hasil sentrifugasi kultur dipekatkan dengan amonium sulfat pada konsentrasi 0–80 %. Aktivitas tertinggi protease digunakan sebagai fraksi terpilih untuk selanjutnya dikarakterisasi terhadap pH dan suhu optimum, efek terhadap penambahan logam dan inhibitor, serta penentuan nilai Km dan Vmaks. Kemampuan isolat dalam memproduksi protease dikonfirmasi dengan deteksi dan analisis gen penyandi protease (prtP/prtM). Hasil konfirmasi identitas isolat berdasarkan gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat IN17 berkerabat dekat dengan Lacticaseibacillus paracasei galur X6 dan Lacticaseibacillus paracasei galur V7776 dengan tingkat kemiripan sebesar 99,92 %. Pemekatan enzim protease ekstrak kasar L. paracasei dengan amonium sulfat pada rentang konsentrasi 0–80 % menunjukkan bahwa pada saturasi 20 % terjadi peningkatan aktivitas spesifik protease sebesar 0,103 U/mg. Aktivitas satu unit enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 µmol tirosin per menit pada kondisi optimum. Kemurnian enzim hasil pemekatan meningkat sebesar 7,36 kali dibandingkan ekstrak kasar dan perolehan (yield) protease yang didapatkan yaitu sebesar 14,7 %. Protease L. paracasei hasil pemekatan memiliki pH optimum pada pH 6 yaitu sebesar 0,051 U/ml dan suhu optimum pada 30 °C yaitu sebesar 0,051 U/ml. Protease ini diaktifkan oleh ion Mn2+ yang ditunjukkan oleh aktivitas protease kontrol meningkat 41,64 % dan 142,53 % setelah ditambahkan ion Mn2+ masing-masing pada konsentrasi 2 mM dan 5 mM. Selain itu, protease ini dihambat 100 % oleh senyawa pengkelat logam berupa EDTA. Analisis nilai Km dan Vmaks menunjukkan dari persamaan Lineweaver-Burk menghasilkan nilai Km 25,14 mg/ml dan nilai Vmaks 1428,57 µmol/mg/min. Amplifikasi gen penyandi protease dilakukan untuk mengonfirmasi kemampuan proteolitik pada genom L. paracasei secara molekuler. Hasil produk PCR yang divisualisasikan pada gel elektroforesis menunjukkan bahwa ukuran pita yang diperoleh ~685 bp. Hasil BLAST-P pada sekuens nukleotida yang telah dideduksi menjadi asam amino menunjukkan bahwa terdapat 2 gen yang teramplifikasi, yaitu prtP dan prtM (homologi: prsA). Gen prtP dan prtM termasuk dalam klaster yang berbeda, yaitu gen prtP termasuk klaster protein PII-type proteinase, sedangkan prtM termasuk klaster protein peptidylpropyl isomerase. Keberadaan kedua gen yang teramplifikasi diprediksi bahwa gen tersebut ditranskripsi dengan arah yang berlawanan sehingga promotor berada di wilayah intragenik. Gen yang berhasil diamplifikasi di antara kedua gen yaitu sekitar 228 asam amino, hanya sebagian kecil dari total asam amino prtP dan prtM yaitu masing-masing sebesar 1902 dan 299 asam amino. Penelitian ini berhasil memurnikan secara parsial dan mengarakterisasi enzim protease dari L. paracasei asal makanan fermentasi ikan inasua. Selain itu, gen penyandi protease prtP/prtM berhasil diamplifikasi dengan ukuran amplikon ~685 bp.

Enzymes are functional proteins that can accelerate chemical reactions and reduce activation energy. Enzyme activity in biochemical processes occurs through the conversion of substrates into products. The use of enzymes is increasing because they have good catalytic efficiency, high specificity, and are environmentally friendly compared to synthetic catalysts. The most widely used enzyme that reaches 60% of the enzyme market demand is protease. Protease is an enzyme that plays a role in hydrolyzing peptide bonds in proteins to produce peptides or amino acids. Protease in the food industry is used to tenderize meat, improve texture, shorten shelf life, clarify drinks, coagulate milk, and produce flavor. Proteases in the non-food industry are used for detergent production, leather processing, pharmaceuticals, silver recovery, and bioremediation. Protease enzyme-producing microorganisms, especially bacteria, have an essential role in industrial applications. This is because bacteria can be cultured, produce high yields, and can be genetically engineered. Proteases produced by bacteria are extracellular so that they can be directly secreted into the fermentation broth. Lactic acid bacteria (LAB) are Gram-positive bacteria that have been widely used for milk fermentation and the manufacture of fermented food and beverage products. Both food and non-food industries utilize LAB because of its Generally Recognized as Safe (GRAS) status. LAB species that are active as proteolytics include Lactococcus salivarius, Lacticaseibacillus casei, and Lactobacillus delbrueckii. Lacticaseibacillus paracasei IN17 isolate from previous research has protease activity with optimum conditions in static treatment, 18 hours of age, pH 7, temperature 30°C, and inhibited by ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). The research was still limited to the crude extract of the enzyme without purification. Therefore, this study aims to conduct partial purification, characterisation and detection of protease encoding genes produced by L. paracasei. This research was conducted in several stages, starting from physiological analysis and molecular analysis. The research phase began with isolate cultivation, isolate identification based on the 16S rRNA gene, and then protease production under optimum culture conditions. These conditions are produced using skim milk with culture incubation at 18 h statically. Protease crude extract from culture centrifugation was concentrated with ammonium sulfate at a concentration of 0–80 %. The highest activity protease was used as the selected fraction for further characterization of the optimum pH and temperature, the effect of the addition of metals and inhibitors, and the determination of Km and Vmax values. The ability of isolates to produce protease was confirmed by the detection and analysis of protease-encoding genes (prtP/prtM). Confirmation of isolate identity based on the 16S rRNA gene showed that isolate IN17 is closely related to Lacticaseibacillus paracasei strain X6 and Lacticaseibacillus paracasei strain V7776 with a similarity level of 99.92%. The concentration of protease enzyme of L. paracasei crude extract with ammonium sulfate in the concentration range of 0–80 % showed that at 20 % saturation, there was an increase in protease-specific activity of 0.103 U/mg. The activity of one unit of enzyme is defined as the amount of enzyme that produces 1 µmol of tyrosine per minute at optimum conditions. The purity of the concentrated enzyme increased by 7.36 times compared to the crude extract, and the protease yield obtained was 14.7%. The concentrated L. paracasei protease had an optimum pH of 0.051 U/ml at pH 6 and an optimum temperature of 0.051 U/ml at 30 °C. This protease was activated by Mn2+ ions as indicated by the control protease activity increased by 41.64 % dan 142.53 % after adding Mn2+ ions at concentrations of 2 mM and 5 mM, respectively. In addition, this protease was inhibited 100 % by the metal-chelating compound EDTA. Analysis of Km and Vmax values showed that the Lineweaver-Burk equation resulted in a Km value of 25.14 mg/ml and a Vmax value of 1428.57 µmol/mg/min. Amplification of the protease encoding gene was performed to confirm the proteolytic ability of the L. paracasei genome molecularly. The results of PCR products visualized on gel electrophoresis showed that the band size obtained was ~685 bp. BLAST-P results on nucleotide sequences that have been reduced to amino acids show that there are two amplified genes, namely prtP and prtM (homology: prsA). The prtP and prtM genes belong to different clusters, the prtP gene belongs to the PII-type proteinase cluster, while prtM belongs to the peptidylpropyl isomerase protein cluster. The presence of the two amplified genes is predicted that the genes are transcribed in the opposite direction so that the promoter is in the intragenic region. The amplified gene is about 228 amino acids, only a fraction of the total amino acids of prtP and prtM, which are 1902 and 299 amino acids, respectively. This study successfully partially purified and characterised the protease enzyme from L. paracasei from inasua fish fermented food. In addition, the protease encoding gene prtP/prtM was successfully amplified with an amplicons size of ~685 bp.