Ekspresi Gen Tillering & Dwarf1 (TAD1) pada Padi Kultivar Hawara Bunar dan Konstruksi Vektor CRISPR/Cas9 untuk Pengeditan Gen TAD1.

Abstract

Padi cv. Hawara Bunar merupakan kultivar padi lokal Sumatra Selatan yang toleran terhadap aluminum dan cekaman kekeringan. Namun, genotipe ini memiliki kekurangan, seperti morfologi yang tinggi dan jumlah anakan yang sedikit sehingga kultivar tersebut tidak menarik secara agronomis. Tinggi tanaman dan jumlah anakan dikendalikan oleh banyak gen; salah satunya adalah gen TAD1, yang meregulasi kedua karakter tersebut secara negatif. Analisis ekspresi gen pada dua kultivar padi yang kontras untuk kedua karakter tersebut merupakan prasyarat untuk pemilihan gen sebagai target penyuntingan gen untuk perbaikan varietas padi. Berdasarkan hal tersebut maka perlu dilakukan modifikasi untuk memperbaiki karakter agronomis padi cv. Hawara Bunar sehingga memiliki habitus lebih pendek dan berproduksi lebih tinggi. Tujuan penelitian ini adalah (1) menganalisis ekspresi gen TAD1 pada padi cv. IR64 dan Hawara Bunar; (2) mengelompokkan gen-gen yang meregulasi tinggi tanaman dan jumlah anakan padi secara filogenetik; (3) melakukan meta-analisis ekspresi gen diferensial; (4) melakukan konstruksi vektor rekombinan CRISPR/Cas9-sgRNA untuk pengeditan gen TAD1 pada cv. Hawara Bunar; (5) memprediksi kejadian mutasi pada gen TAD1 hasil pengeditan dengan CRISPR/Cas9. Analisis ekspresi gen TAD1 dilakukan dengan menggunakan teknik qRT PCR dengan cDNA yang disintesis dari RNA total daun muda padi pada fase pre tillering dan fase tillering. Perhitungan ekspresi relatif menggunakan metode 2-∆∆Ct. Filogenetik dikonstruksi menggunakan data sekuen DNA dan sekuen asam amino (protein) dari gen-gen penentu tinggi tanaman dan jumlah anakan pada padi. Sekuen DNA dan protein TAD1 berasal dari cv. HB, sedangkan sekuen pembandingnya dikoleksi dari NCBI. Pensejajaran sekuen DNA dan protein menggunakan metode Clustal W dengan perangkat lunak UGENE dan penyusunan filogenetik menggunakan perangkat lunak PAUP4. Analisis ekspresi gen diferensial menggunakan set data transkriptom dari 2 studi pada percobaan gen yang memengaruhi tinggi tanaman dan jumlah anakan padi yang diperoleh dari NCBI. Cloning sgRNA ke vektor pRGEB32 menggunakan teknik Golden-Gate, dan prediksi mutasi dianalisis menggunakan I-Tasser, SusPect, dan Uniprot dengan memasukkan data protein TAD1 padi cv. Hawara Bunar. Hasil penelitian menunjukkan ekspresi gen TAD1 pada fase tillering padi cv. Hawara Bunar lebih tinggi daripada cv. IR64. Perbedaan ekspresi relatif gen TAD1 pada cv. HB dan IR64 sesuai dengan fenotip kedua kultivar tersebut, yaitu padi cv. HB yang memiliki tinggi berkisar antara 112-150 cm dengan 6 nodus dan memiliki rata-rata 2 anakan, sedangkan padi IR64 memiliki tinggi berkisar antara 51-85 cm dengan 5 nodus dan memiliki rata-rata anakan sebanyak 5. Pada percobaan ini, fase generatif padi cv. HB memiliki 1-3 anakan produktif, sedangkan padi cv. IR64 dapat menghasilkan anakan 5-7 anakan produktif. Pemilihan gen TAD1 dari berbagai gen yang meregulasi tinggi dan jumlah anakan padi diperkuat dengan hasil analisis filogenetik yang menunjukkan posisi yang kuat yaitu pada clade I, dengan gen-gen yang diekspresikan pada saat siklus sel. Clade I terdiri dari gen-gen yang memengaruhi tinggi tanaman padi dengan jumlah anakan sedikit melalui jalur biosintesis hormon strigolakton. Berbeda dengan clade I, clade II tediri dari gen-gen dengan pengaruh sebaliknya yaitu meningkatkan jumlah anakan padi dengan morfologi yang lebih pendek melalui regulasi pertumbuhan dan perkembangan meristem aksilar sehingga mendorong pembentukan anakan pada padi. Sebanyak 16 aksesi gen in group dalam pohon filogenetik ditemukan pada lokus yang berhasil dipetakan melalui meta-analisis dengan set data SSR dari studi Chen et al. (2020), khususnya gen TAD1 dengan lokus Os03g0123300. Aksesi gen TAD1 mengelompok dengan gen-gen yang terekspresi downregulated pada plot volcano menandakan bahwa gen TAD1 adalah gen yang penting untuk meregulasi tinggi tanaman dan jumlah anakan pada padi dengan mekanisme downregulated terhadap gen MOC1. Sekuen oligo sgRNA yang didesain pada ekson 1 telah berhasil di klon ke vektor pRGEB32 dan diintroduksi ke bakteri Agrobacterium tumefaciens. Vektor rekombinan yang dibawa bakteri transforman diintroduksi ke bakteri A. tumefaciens melalui teknik Triparental Mating (TPM). Seleksi hasil TPM menggunakan antibiotik kanamisin dan streptomisin dengan konsentrasi masing masing 50 ppm. Hasil introduksi menunjukkan koloni A. tumefaciens yang membawa plasmid rekombinan CRISPR/Cas9-sgRNA berhasil tumbuh. Berdasarkan prediksi perubahan basa nukleotida (mutasi) yang mungkin terjadi, situs komplemen sgRNA memiliki peluang terjadinya frameshift mutasi yang tinggi yaitu 83.33%. Prediksi mutasi pada sekuen target menunjukkan perubahan asam amino protein TAD1 antara asam amino ke 229-234. Mutasi yang terjadi pada gen TAD1 sebagai master regulator diprediksi akan menyebabkan padi cv. HB mutan memiliki morfologi yang lebih pendek dan anakan yang lebih banyak dibandingkan tipe liarnya. Hal ini karena regulasi sifat anakan dan tinggi tanaman pada padi oleh gen TAD1 berkorelasi negatif. Semakin banyak jumlah anakan yang diproduksi maka semakin pendek morfologi dari tanaman padi.