Populasi, Identifikasi dan Deteksi Fragmen Gen Penghasil Aflatoksin Aspergillus flavus pada Kacang Tanah dan Produk Olahannya

Abstract

Aspergillus flavus merupakan spesies cendawan utama yang menghasilkan aflatoksin. Keberadaan cendawan ini dan aflatoksinnya pada bahan pangan menjadi masalah utama pada keamanan pangan. Penelitian ini bertujuan untuk menghitung populasi dan mengidentifikasi A. flavus dari biji kacang tanah dan produk olahannya, mendeteksi empat macam gen biosintesis aflatoksin dan produksi aflatoksinnya secara kualitatif, dan analisis filogenetik berdasarkan sekuen omt-1. Metode isolasi terlebih dahulu distandarisasi menggunakan kultur standar A. flavus 747 pada biji kacang tanah dengan parameter penghitungan nilai presisi, akurasi, limit deteksi dan limit kuantitasi. Sampel biji kacang tanah, kacang atom, kacang garing dan bumbu pecel diambil dari pasar tradisional di daerah Bogor, Depok dan Jakarta. Isolasi cendawan dilakukan menggunakan medium spesifik Aspergillus flavus parasiticus Agar. Identifikasi cendawan dilakukan berdasarkan morfologi dan molekuler menggunakan primer spesifik spesies, yaitu FVAVIQ1/FLAQ2 dan AFLA-F/AFLA-R. Deteksi bagian dari gen yang terlibat dalam biosintesis aflatoksin menggunakan 4 pasang primer, yaitu apa-2, nor-1, ver-1 dan omt-1. Produksi aflatoksin dideteksi dengan menumbuhkan isolat di media Coconut Agar Medium pada umur kultur 5 hari yang dipaparkan sinar UV dengan panjang gelombang 365 nm. Analisis pohon filogenetik dilakukan terhadap 3 perwakilan isolat menggunakan software Mega 5 dengan metode Neighbor Joining dan model Kimura 2-paramater serta bootsrap 1000 kali. Hasil uji standarisasi metode isolasi A. flavus menunjukkan bahwa metode yang digunakan memenuhi persyaratan. Populasi A. flavus 747 pada semua ampul yang diuji homogen dan stabil, dengan nilai akurasi 97.04-100%, presisi 1.1- 1.9%, limit deteksi 50 cfu/mL dan limit kuantitasi 120 cfu/mL. Hasil isolasi menunjukkan bahwa pada 36 sampel yang diuji, cendawan kelompok A. flavus hanya ditemukan pada biji kacang tanah dengan populasi sebanyak 0.01-5.52 x 104 cfu/g, dan tidak ditemukan pada produk olahannya. Sebanyak 18 isolat yang diperoleh diidentifikasi sebagai spesies A. flavus berdasarkan karakteristik morfologi dan molekuler dengan primer spesifik spesies menghasilkan amplikon berukuran sekitar 100 dan 413 bp. Hasil deteksi dengan 4 primer dari gen biosintesis aflatoksin menunjukkan bahwa semua isolat dapat teramplifikasi oleh primer apa-2 dan nor-1, 15 isolat teramplifikasi oleh primer omt-1 dan 13 isolat teramplifikasi oleh primer ver-1 yang secara berturut-turut menghasilkan ukuran amplikon sekitar 1032, 400, 895 dan 1024 bp. Sebanyak 3 dari 18 isolat yang tidak menghasilkan amplikon omt-1 tidak menghasilkan aflatoksin karena tidak berpendar di bawah paparan sinar UV. Hasil analisis pohon filogenetik menunjukkan bahwa isolat A. flavus B1 dan B2 yang toksigenik asal Bogor berada pada cabang yang terpisah dengan isolat A. flavus D1 asal Depok yang juga toksigenik