Desain Marka Sgrna-Knockout CRISPR/Cas9 In Silico Gen Laktat Dehidrogenase Clostridium thermocellum Untuk Meningkatkan Produksi Biohidrogen

Abstract

Fermentasi gelap merupakan metode yang dapat digunakan untuk memproduksi hidrogen dari limbah biomassa menggunakan mikroba anaerobik. Selama proses fermentasi dihasilkan beberapa produk samping salah satunya yaitu asam laktat. Asam laktat merupakan asam organik yang pembentukannya dikatalis oleh L – laktat dehidrogenase (LDH). LDH pada tingkat gen diekspresikan oleh ldh. Keberadaan asam laktat dalam konsentrasi tinggi diduga dapat menghambat proses fermentasi dan mengurangi jumlah produksi hidrogen. Penelitian ini bertujuan mendesain RNA pemandu (sgRNA) untuk menghambat pembentukan asam laktat dengan melumpuhan gen ldh melalui rekayasa genom CRISPR/Cas9. Metode ini diawali dengan mendesain sgRNA berdasarkan coding sequence (CDS) menggunakan alat desain Geneious serta dievaluasi efiseinsinya. Selanjutnya, sgRNA dikontruksi ke plasmid menggunakan Benchling. sgRNA hasil desain yang diperoleh yaitu 5'AAGATAACGGAACCTGGCTG3' (20nt) dengan PAM 5’TGTCCAAA3’ (8nt). Sekuen sgRNA memiliki nilai off – target MIT dan CFD 100,jumlah GC 50% dan membentuk kodon stop pada sekeun target.

Dark fermentation is a method that can use to produce hydrogen from waste biomass using anaerobic microbes. During the fermentation, several byproducts are produced, lactic acid is one of which. Lactic acid is an organic acid whose formation is catalyzed by L – lactic dehydrogenase (LDH). LDH on gene-level expressed by ldh. A high concentration of lactic acid is thought to inhibit fermentation and reduce the amount of hydrogen. This study aims to design a guide RNA (sgRNA) to inhibit the formation of lactic acid by inactivating ldh through CRISPR/Cas9. This method begins with designing the sgRNA using the Geneious design tool and evaluating its efficiency. Next, sgRNA constructs to plasmid using Benchling. The design sgRNA obtained is 5'AAGATAACGGAACCTGGCTG3' (20nt) with PAM 5'TGTCCAAA3' (8nt). The sgRNA sequence has an off-target value of MIT and CFD of 100, the number of GC is 50%, and forms a stop codon on the target sequence.