Karakterisasi genom mitokondria labi-labi Amyda cartilaginea (Boddaert 1770) dan diferensiasi genetiknya pada populasi Sumatera dan Jawa

Abstract

Labi-labi atau bulus merupakan kura-kura famili Trionychidae dan termasuk salah satu anggota dari ordo Testudines (bangsa kura-kura) dan kelas Reptilia. Kura-kura jenis ini berbeda dari kura-kura biasa pada umumnya yang memiliki cangkang/ tempurung yang keras, akan tetapi kura-kura ini memiliki cangkang/tempurung yang sebagian besar terdiri dari tulang rawan sehingga disebut sebagai kura-kura cangkang lunak. Amyda cartilaginea merupakan salah satu anggota dari kura-kura cangkang lunak (Trionychidae) yang banyak tersebar di beberapa negara Asia termasuk Indonesia, sehingga spesies ini juga disebut sebagai Asiatic soft-shell turtle (kura-kura cangkang lunak Asia). Di Indonesia A. cartilaginea tersebar di Pulau Sumatera, Jawa, dan Kalimantan. A. cartilaginea hidup di perairan tawar seperti sungai, danau maupun kolam yang terhubung dengan sungai dan hidupnya akuatik atau lebih banyak menghabiskan hidupnya di dalam air daripada di daratan. Kura-kura cangkang lunak spesies A. cartilaginea juga termasuk kedalam komoditas perikanan dan banyak dimanfaatkan oleh masyarakat untuk dikonsmsi, dijadikan sebagai bahan pengobatan tradisional, juga sebagai hewan peliharaan. Karena pemanfaatannya tersebut kura-kura jenis ini banyak diperdagangkan baik di pasar domestik maupun pasar internasional, sehingga menyebabkan terjadinya penangkapan berlebihan di alam yang pada akhirnya juga menyebabkan penurunan populasi di alam. Terjadinya penurunan populasi di alam ini menjadi perhatian penting untuk terus dilakukannya pemantauan dan penelitian dari berbagai aspek guna menunjang konservasi dan manajemen populasi untuk mencegah penurunan populasi yang terus menerus dan menjaga kestabilan populasi yang masih tersissa di alam. Penetian terhadap spesies ini belum banyak dilakukan terutama pada penelitian berbasis molekuler, untuk itu tujuan dari penelitian ini yaitu mengkarakterisasi genom mitokondria serta melihat variasi genetik dari A. cartilaginea populasi Sumatera dan Jawa berdasarkan penanda d-loop. Sampel A. cartilaginea untuk karakterisasi genom berasal dari Sungai Batanghari Kabupaten Dharmasraya Sumatera Barat dan sampel A. cartilaginea untuk analisis variasi genetik berasal dari dua populasi berbeda yaitu Sumatera (Jambi dan Palembang) dan Jawa. Ekstraksi DNA menggunakan kit ekstraksi. Amplifikasi gen mitokondria untuk karakterisasi genom menggunakan beberapa primer yang di desain mengikuti organisasi gen pada labi-labi spesies Dogania subplana (accession number AF66350), sedangkan amplifikasi untuk variasi genetik menggunakan sepasang primer d-loop fragmen tengah AF574 (5’–TCACG AGAGATAAGCAACC –3’) dan AF575 (5’– GTCAAACCCCAAAATCCGAG – 3’). Sekuens basa nukleotida hasil sekuensing diedit menggunakan program Bioedit. Urutan DNA yang telah diedit, disejajarkan menggunakan Clustal W pada program MEGA 7.0. Rekonstruksi pohon filogeni menggunakan metode Neighbor-joining dengan nilai bootstrap 1000 kali. Analisis variasi genetik dan haplotipe menggunakan program dnaSP dan mambuat haplogrup dengan Median joining pada program Network. Hasil analisis telah berhasil mengkarakterisasi genom mitokondria pada A. cartilaginea dengan ukuran 7757 pb dari total perkiraan panjang genom mitokondria 17.000 bp. Penelitian ini telah mendapatkan data sebanyak 48% dari keseluruhan (whole) genom mitokondria pada A. cartilaginea. Hasil penelitian ini telah mampu mengkarakterisasi 2 gen yang menyandikan rRNA (ribosomal RNA), 5 gen yang menyandikan tRNA (transfer RNA), dan 8 gen yang menyandikan protein. Susunan organisasi gen pada A. cartilaginea ditemukan identik dengan labi-labi spesies D. subplana dan P. cantorii. Hasil analisis filogenetik menempatkan spesies A. cartilaginea bersama dengan spesies kura-kura cangkang lunak lain dengan spesies D. subplana sebagai kerabat paling dekat dibanding spesies lain. Hasil analisis variasi genetik A. cartilaginea populasi Sumatera dan Jawa berdasarkan fragmen tengah d-loop menemukan ada 18 situs basa nukleotida yang mengalami variasi (situs polimorfik). Dari 18 situs variasi tersebut 12 diantaranya dapat dijadikan sebagai penanda/penciri A. cartilaginea populasi Jawa, karena basa nukleotida tersebut hanya dapat ditemukan pada A. cartilaginea populasi Jawa dan tidak ditemukan pada A. cartilaginea populasi Sumatera. Hasil analisis haplotipe pada 18 sampel populasi Sumatera dan Jawa yang digunakan menemukan adanya 9 haplotipe. Pada haplotipe ini memisahkan sampel populasi Sumatera dan Jawa.

Labi-labi or bulus is a turtle of the family Trionychidae and is a member of the order Testudines and class Reptilia. This turtle is different from an ordinary turtle in general with a hard shell, but this turtle has a shell mainly consisting of cartilage and known as a soft-shell turtle. Amyda cartilaginea is a member of the soft-shell turtle (Trionychidae), widely distributed in several Asian countries, including Indonesia, so this species is also known as the Asiatic soft-shell turtle. In Indonesia, A. cartilaginea is widely spread in Sumatra, Java and Kalimantan. A. cartilaginea lives in freshwaters such as rivers, lakes or ponds connected to rivers and mostly aquatic. The soft-shell turtle of A. cartilaginea is also included in fishery commodities and is widely used for consumption, ingredients for traditional medicine and pets. Due to its utilization, this species is widely traded in domestic and international markets—the trade causing overfishing in the wild, which also causes population decrease in the wild. Conservation and management population is needed to prevent the population decrease in the wild. So that, various studies are required from several aspects, primarily in molecular-based research. This study aims to characterize the mitochondrial genome and see the genetic variations of A. cartilaginea populations of Sumatra and Java-based on d-loop markers. The samples of A. cartilaginea used for genomic characterization caught from Batanghari river in Dharmasraya West Sumatera, and the samples used for genetic variation from two different populations, Sumatra (Jambi and Palembang) and Java. DNA extraction using an extraction kit. Mitochondrial gene amplification for genomic characterization used several primers designed to follow the gene organization of the Dogania subplana species (accession number AF66350). In contrast, the amplification for genetic variation used a pair of d-loop primers in the middle fragment AF574 (5'– TCACGAGATAAG CAACC – 3 ') and AF575 (5'– GTCAAACCCCAAAATCC GAG – 3'). The sequenced nucleotide bases were edited using the Bioedit program. The DNA sequences were aligned using Clustal W in the MEGA 7.0 program. Reconstruction of the phylogeny tree using the neighbor-joining method with a bootstrap value of 1000 times. Analysis of genetic variation and haplotypes using the dnaSP program and creating haplogroups with median-joining in the Network program. The result of mitochondrial genome in A. cartilaginea were obtain 7757 bp from the estimated total length of the mitochondrial genome of 17,000 bp. Thus, this study has obtained data as much as 48% of the whole mitochondrial genome in A. cartilaginea. The results of this study were able to characterize 2 rRNA-coding genes, 5 tRNA-coding genes, and 8 protein-coding genes. Organization genes in A. cartilaginea were found identic with species D. subplana and P. cantorii. The phylogenetic analysis placed the species A. cartilaginea together within other soft-shell turtles, and A. cartilaginea has the closest relationship to D. subplana compared to other species. The genetic variation of A. cartilaginea populations of Sumatra and Java based on the middle d-loop fragment found that 18 nucleotide bases were variated (polymorphic sites). Among the 18 polymorphic sites, 12 of them can be used as markers of A. cartilaginea in the Javan population. These nucleotide bases only found in A. cartilaginea in the Javan population and not in the Sumatran population. Haplotype analysis on 18 samples of the Sumatran and Java populations found nine haplotypes. This haplotype separates the population samples from Sumatra and Java.