Studi DNA Barcoding Diospyros spp. Kawasan Malesia

Abstract

Diospyros spp. di kawasan Malesia memiliki keanekaragaman yang tinggi dan berpotensi sebagai komoditi ekonomi. Namun, banyak Diospyros spp. yang belum teridentifikasi dan kurang tepat dalam identifikasi serta penamaannya sehingga keanekaragaman tersebut perlu dikonfirmasi. Identifikasi hingga tingkat jenis pada marga Diospyros spp. sulit dilakukan karena keberadaan organ generatif (bunga dan buah) jarang ditemukan sedangkan organ generatif merupakan ciri pembeda yang biasa digunakan untuk identifikasi jenis dari marga Diospyros spp. Pendekatan DNA barcoding pada daun dapat digunakan dalam identifikasi jenis spesimen hidup Diospyros spp. di kawasan Malesia. Tujuan dari penelitian ini untuk memberikan informasi mengenai keanekaragaman Diospyros spp. di kawasan Malesia melalui pendekatan DNA barcoding dan mengungkapkan informasi filogeni Diospyros spp. di kawasan Malesia. Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei 2020 hingga Februari 2021 di Laboratorium Molekuler Pusat Penelitian Konservasi Tumbuhan dan Kebun Raya, LIPI. Sampel Diospyros spp. diambil dari koleksi Kebun Raya Bogor. Prosedur pengamatan DNA barcoding meliputi empat tahap utama yaitu ektraksi DNA, amplifikasi, visualisasi DNA dan produk PCR, serta sekuensing. Primer barcoding yang digunakan berasal dari plastida trnL-F intergenic spacer (IGS). Data sekuen DNA barcoding dianalisis menggunakan perangkat lunak BioEdit untuk proses konstruksi konsensus sekuen. Selanjutnya dilakukan data mining melalui BLAST secara online untuk identifikasi kemiripan sekuen berdasarkan database yang terdapat di National Center for Biotechnology Information (NCBI), Multiple alignment sequences melalui multiple sequence comparison by log-expectation (MUSCLE) dan konstruksi pohon filogenetik dengan metode Maksimum Parsimoni (MP) dan algoritma Tree-Bisection-Regrafting (TBR) yang dilakukan menggunakan perangkat lunak MEGA X dengan pairwise deletion option dan bootstrap 1000x. Konstruksi pohon filogenetik menggunakan 20 aksesi Diospyros spp yang disekuensing, 40 aksesi sekuen Diospyros spp. hasil BLAST dan empat outgroup berasal dari database NCBI. Keanekaragaman Diospyros spp. di kawasan Malesia telah diungkapkan terhadap 20 aksesi yang mewakili 18 jenis Diospyros. melalui pendekatan DNA barcoding dengan menggunakan primer trnL-F IGS. Sepuluh jenis Diospyros merupakan informasi sekuen baru yang dipublikasikan di Kawasan Malesia. Berdasarkan lokasi asal aksesi, Diospyros paling banyak ditemukan di Pulau Jawa (6 aksesi) dan Sulawesi (5 aksesi), sedangkan yang paling sedikit ditemukan di Pulau Sumatra dan Filipina, masing-masing satu aksesi. Validasi pada 20 aksesi Diospyros dengan data sekuen pada GenBank menunjukkan adanya hubungan kekerabatan dengan 44 jenis Diospyros lainnya di dunia. Rata-rata frekuensi nukleotida pada sekuen trnL-F IGS dalam Diospyros spp. adalah 34,7 % (T), 21,0 % (C), 29,2 % (A), dan 15,0 % (G). Analisis filogenetik menggunakan metode maksimum parsimoni dan 1000 ulangan bootstrap pada 68 DNA sekuen (64 Diospyros spp. dan empat outgroup) menghasilkan satu pohon filogeni yang kokoh dengan nilai consistensy index (CI) 0,82 dan retention index (RI) 0,89. Semua Diospyros spp. yang dianalisa membentuk satu kelompok monofiletik dan selanjutnya terbagi menjadi tujuh klada. Ketujuh klada ini memperbarui data filogenetik Diospyros di Kawasan Malesia. Hipotesis kedekatan biogeografi mendukung hasil filogenetik. Distribusi jenis dalam klada ditentukan berdasarkan kemiripan basa nukleotida dan juga dapat dikelompokkan berdasarkan sebaran dari Diospyros tersebut: Kawasan Malesia (klada I dan V), Kawasan Malesia-Kaledonia (klada III dan IV), Kosmopolit hampir di semua bioregion (klada II, VI dan VII).