Indirect Ezyme Linked Immunosorbent Assay (I-ELISA) sebagai Metode untuk Mendeteksi Bruselosis pada Sapi Perah

Abstract

Bruselosis menjadi salah satu penyakit zoonotik yang mendapat perhatian dalam upaya pencegahan dan pemberantasan penyakit hewan menular strategis di Indonesia. Bruselosis disebabkan oleh bakteri Gram-negatif intraseluler dari genus Brucella, yang bertanggung jawab untuk menularkan penyakit pada manusia dan infeksi kronis pada hewan domestik. Bruselosis bisa dideteksi lebih awal dengan uji rose bengal test (RBT), kemudian dilanjutkan dengan uji pengikatan komplemen atau complement fixation test (CFT), dan uji enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Penelitian mengenai deteksi bruselosis telah banyak dilakukan dengan menggunakan berbagai metode. Gold standard untuk mendeteksi bruselosis adalah kultur bakteri dari sampel darah, sumsum tulang, dan kelenjar getah bening atau cairan serebrospinal dengan spesifisitas tinggi, namun sensitifitasnya rendah karena sulitnya tingkat pertumbuhan. Uji ELISA secara internasional merupakan uji standar yang direkomendasikan oleh OIE untuk bruselosis baik pada ruminansia besar maupun kecil. Teknik ELISA untuk mendeteksi bruselosis salah satunya adalah ELISA tipe tidak langsung atau indirect enzyme linked immunosorbent assay (I-ELISA). Uji I-ELISA untuk bruselosis pada kambing, domba dan sapi telah dikembangkan pada tahun 2015 sampai 2016 dengan sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi. Uji I-ELISA yang dikembangkan ini perlu diteliti lebih lanjut sebagai uji alternatif dibandingkan dengan uji RBT, CFT, dan I-ELISA komersial untuk mendeteksi bruselosis pada sapi perah. Penelitian ini bertujuan sebagai kajian terhadap uji I-ELISA menjadi uji alternatif untuk mendeteksi bruselosis pada sapi perah. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang metode yang lebih cepat, akurat, sensitif, spesifik, mudah, dan memiliki kesesuaian (agreement) yang baik untuk mendeteksi bruselosis pada sapi perah. Metode yang digunakan adalah dengan melakukan uji RBT, CFT, I-ELISA yang dikembangkan, dan I-ELISA komersial untuk mendeteksi bruselosis pada sapi perah. Prosedur uji RBT menggunakan sampel serum, kontrol positif, kontrol negatif yang ditambahkan antigen RBT, kemudian campuran serum dan antigen dilakukan homogenisasi membentuk lingkaran atau oval menggunakan batang pengaduk kaca pada masing-masing sampel. Sampel dinyatakan positif apabila terjadi gumpalan seperti pasir. Prosedur uji CFT tahap pertama adalah reaksi Ag Brucella dan contoh serum dicampur sejumlah komplemen menggunakan serum marmut normal (komplemen) dengan konsentrasi 10%. Jika contoh serum mengandung antigen terhadap Brucella maka komplemen akan mengikat antigen dan antibodi tersebut. Tahap kedua adalah komplemen tidak dapat mengikat indikator (sel darah domba) yang direaksikan dengan anti sel darah domba (hemolisin). Hemolisin diperoleh dari domba yang diberi perlakuan dengan menginjeksikan antigen B. abortus 2 minggu sebelum pengambilan darah, sehingga darah domba yang diperoleh adalah darah domba yang telah dilapisi antibodi terhadap B. abortus. Sistem indikator atau hemolisin terdiri dari sel darah domba (konsentrasi 3%) yang dilapisi antibodi. Penghancuran sel darah domba yang telah dilapisi hemolisin (sistem indikator). Sampel positif ditandai dengan tidak terjadinya lisis sel darah domba, cairan berwarna bening, dan terdapat endapan eritrosit. Sampel negatif ditandai dengan lisisnya sel darah domba dan cairan berwarna merah muda. Titer CFT dibaca sesuai dengan pengenceran tertinggi sumur yang masih positif. Sampel dikatakan positif apabila memiliki titer ¼ atau lebih. I-ELISA yang dikembangkan dan I-ELISA komersial merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen atau antibodi. Teknik tersebut memiliki karakteristik yaitu antigen tidak menempel langsung pada antibodi detector (indirect). Antigen akan berikatan dengan antibodi lain terlebih dahulu. Antibodi tersebut kemudian akan berikatan dengan antibodi yang telah dilabeli. Kelebihan indirect ELISA yaitu memiliki sensitifitas tinggi dan sinyal amplifikasi yang tinggi. Kekurangan indirect ELISA yaitu membutuhkan waktu yang lama dan terjadi reaksi silang. Uji I-ELISA yang dikembangkan menggunakan teknik preparasi antigen smooth lipopolisakarida (S-LPS) melalui modifikasi proses pengendapan yang memisahkan S-LPS berdasarkan panjang rantai polisakarida untuk meningkatkan spesifisitas. Uji I-ELISA komersial menggunakan kit dari ID VET dengan antigen yang sudah dilakukan coating pada sumur microplate. Hasil uji akan dihitung sensitifitas dan spesitifitasnya, serta dilakukan analisis dengan perhitungan nilai kappa. Hasil perhitungan sensitifitas dan spesifisitas menunjukkan uji I-ELISA yang dikembangkan memiliki sensitifitas (100%) lebih tinggi dibandingkan dengan uji RBT (93.75%) dan I-ELISA komersial (93.75%). Spesifisitas I-ELISA yang dikembangkan (62.10%) lebih rendah dibandingkan dengan RBT (89.87%) dan I-ELISA komersial (70.52%). Perhitungan nilai kappa RBT dengan CFT menunjukkan nilai kappa 0.7120 yang berarti memiliki kesesuaian baik (good agreement), I-ELISA komersial dengan CFT menunjukkan nilai kappa 0.6165 yang berarti memiliki kesesuaian baik, sedangkan I-ELISA yang dikembangkan dengan CFT menunjukkan nilai kappa 0.4984 yang berarti memiliki kesesuaian sedang (moderate agreement). Kesimpulannya hasil uji I-ELISA yang telah dikembangkan memiliki spesifisitas yang rendah, tetapi sensitifitasnya paling tinggi dibandingkan dengan uji I-ELISA komersial dan RBT, sehingga uji ini tepat digunakan sebagai uji screening khususnya pada lalu lintas sapi perah menuju daerah atau wilayah bebas bruselosis. Hasil positif uji screening kemudian diuji menggunakan uji konfirmasi yang sangat spesifik untuk meminimalkan jumlah keseluruhan positif palsu pada akhir proses pengujian. Hasil perhitungan nilai kappa untuk uji I-ELISA yang telah dikembangkan menunjukkan uji ini memiliki kesesuaian uji sedang terhadap CFT, yang berarti kesesuaian I-ELISA yang dikembangkan dengan CFT tidak terlalu baik, sehingga uji I-ELISA yang dikembangkan tidak sesuai digunakan sebagai uji pengganti CFT.