Aktivitas Filtrat Fusarium Endofit asal Pohon Kina (Cinchona calisaya) sebagai Anti-plasmodiumGayuh Rahayu

Abstract

Fusarium endofit mampu menghasilkan beragam metabolit sekunder seperti antibiotik, antioksidan, anti-diabetes, anti-kanker dan anti-malaria. Salah satu senyawa yang memiliki aktivitas anti-malaria adalah alkaloid kina. Senyawa ini secara alami diproduksi dari kulit batang pohon kina (Cinchona spp.). Saat ini, populasi pohon kina di Indonesia menurun, sehingga ketersediaan alkaloid kina menjadi sangat terbatas. Dua galur Fusarium spp. endofit dari pohon kina asal Indonesia yaitu Fusarium solani IPBCC 15.1247 dan F. oxysporum IPBCC 15.1250 dilaporkan mampu menghasilkan senyawa alkaloid kina dalam 21 hari. Namun, aktivitasnya sebagai anti-plasmodium belum diketahui. Oleh sebab itu, penelitian ini bertujuan untuk menganalisis adanya senyawa alkaloid kina dalam filtrat Fusarium spp. endofit pohon kina dan menguji aktivitas anti-plasmodiumnya terhadap P. berghei dalam darah mencit. Alkaloid kina diproduksi dengan menumbuhkan tiga potong inokulum Fusarium spp. (diameter 0.8 cm) pada 200 mL medium PDB. Kultur diinkubasi selama 21 hari dalam keadaan statik di bawah kondisi cahaya dengan intensitas 1000 lux. Pada akhir masa inkubasi, filtrat dipisahkan dari miselium menggunakan kertas saring. Filtrat dibagi menjadi dua bagian, sebagian untuk deteksi alkaloid kina dan sebagian lainnya untuk uji aktivitas anti-plasmodium. Filtrat diekstraksi dengan kloroform pada nisbah 1:1. Kandungan alkaloid kina dideteksi menggunakan alat kromatografi cair kinerja tinggi pada panjang gelombang 210 nm. Sebelum uji anti-plasmodium, filtrat diuji toksisitas akutnya menggunakan mencit DDY yang sehat (berat badan 20-30 gram dan berumur 2 bulan). Filtrat F. solani dan F. oxysporum diberikan dengan volume 0.1; 0.2 dan 0.4 mL/mencit. Mencit yang diberi air minum dijadikan kontrol negatif dan mencit yang diberi 0.2 mL PDB/mencit dijadikan kontrol PDB. Semua perlakuan diberikan sekali pada awal percobaan dan dilakukan sebanyak lima ulangan. Gejala keracunan ditunjukkan oleh perubahan pada rambut, terjadinya letargi, konvulsi, tremor, diare, dan kematian. Gejala keracunan diamati selama 4 jam pertama setelah pemberian filtrat dengan interval 30 menit. Jika selama 4 jam pertama tidak terjadi kematian, pengamatan diperpanjang hingga hari ke-7. Pada hari ke-7 mencit dinekropsi untuk diamati perubahan patologi anatomi pada organ hati, ginjal, dan limpa yang dibandingkan dengan kontrol negatif dan kontrol PDB. Volume filtrat yang tidak bersifat toksik dievaluasi aktivitas anti-plasmodiumnya. Volume filtrat F. solani dan F. oxysporum yang tidak bersifat toksik diberikan pada mencit yang terinfeksi P. berghei (tingkat parasitemia > 10%). Mencit yang terinfeksi diberi air minum, 0.2 mL PDB/mencit dan 1000 μg DHP/mencit, masing-masing dijadikan sebagai kontrol negatif, kontrol PDB dan kontrol positif. Perlakuan diberikan satu kali sehari selama 4 hari sebanyak 5 ulangan. Tingkat parasitemia pada mencit diamati selama 11 hari (H1-H10). Persentase parasitemia ditentukan melalui pengamatan mikroskopis dari ulasan darah tipis pada pewarnaan Giemsa. Data persentase parasitemia dianalisis statistik menggunakan ANOVA dalam perangkat lunak SPSS 22.0. Perbedaan nyata diantara perlakuan diperoleh melalui uji DMRT pada taraf 5% (p < 0.05). Kromatogram dari KCKT pada filtrat F. solani dan F. oxysporum menunjukkan keberadaan dua puncak, salah satu puncak tersebut memiliki Rt yang sama dengan kuinidina standar (Rt 9.94 menit). Konsentrasi kuinidina standar sangat berkorelasi (R2 = 1) dengan area dibawah puncak, sehingga kadar kuinidina pada filtrat dapat dihitung menggunakan persamaan y = 123915x + 1442.8. Pada penelitian ini konsentrasi kuinidina yang dihasilkan dalam filtrat F. oxysporum dan F. solani masing-masing sebesar 9.892 μg/mL dan 16.694 μg/mL. Mencit yang diberi filtrat F. solani dan F. oxysporum pada semua tingkatan volume tidak menunjukkan gejala keracunan. Oleh sebab itu, filtrat Fusarium dapat digunakan dalam uji aktivitas anti-plasmodium. Sebelum uji anti-plasmodium, persentase parasitemia untuk semua perlakuan pada mencit relatif sama dan tidak berbeda nyata yaitu antara 12-13%. Pada hari ke-1 (H1), persentase parasitemia pada mencit yang diberi DHP (6.56%) tidak berbeda nyata dibandingkan 0.4 mL filtrat F. solani (10.40%), sedangkan semua perlakuan mengalami peningkatan. Berbeda dengan hari ke-1 (H1), persentase parasitemia pada mencit yang diberi semua filtrat mengalami penurunan pada hari ke-2. Namun, hanya parasitemia pada mencit yang diberi filtrat F. solani yang tidak berbeda nyata dibandingkan DHP. Pada hari ke-3, parasitemia pada mencit yang diberi DHP menurun hingga 0%, yang artinya mencit telah terbebas dari infeksi P. berghei. Walaupun parasitemia pada mencit yang diberi F. solani tidak berbeda nyata dibandingkan DHP, akan tetapi persentase parasitemia pada mencit yang diberi filtrat F. solani tidak mampu menurunkan hingga 0%. Parasitemia pada mencit yang diberi filtrat F. solani dan F. oxysporum masing-masing sebesar 8.73-9.04% dan 15.22-16.13%. Penurunan parasitemia masih terjadi pada hari ke-4 (H4) setelah pemberian filtrat dihentikan, akan tetapi tidak ada satupun perlakuan yang mampu membebaskan mencit dari infeksi P. berghei. Oleh karena itu, DHP lebih efektif dibandingkan filtrat kultur Fusarium. Berdasarkan persentase penghambatan parasitemia, DHP menghambat P. berghei hingga 100%. Pemberian filtrat F. solani pada semua volume mampu menghambat P. berghei sebesar 72.31%-78.41%, sebaliknya mencit yang diberi filtrat F. oxysporum pada volume yang sama mampu menghambat hingga 62.18-70.81%. Berdasarkan hasil tersebut filtrat F. solani lebih efektif dibandingkan filtrat F. oxysporum. Pada kontrol negatif, penghambatan parasitemia sebesar 0%, yang artinya tidak mampu menghambat perkembangan P. berghei. Berdasarkan tingkatan volume dan efektivitas filtrat dengan DHP pada semua volume uji, filtrat F. solani dan F. oxysporum berpotensi untuk dikembangkan sebagai anti-plasmodium.