Analisis Keragaman Bakteri Filosfer Padi dengan Metode T-RFLP

Abstract

Lingkungan filosfer merupakan daerah di bagian tanaman yang berada di atas tanah dan dihuni oleh berbagai mikrob seperti bakteri, cendawan, khamir, dan sebagian kecil protozoa. Bakteri merupakan mikrob paling dominan yang menghuni lingkungan filosfer dan biasanya bersifat komensal bagi tanaman inang. Keberadaan bakteri filosfer diduga berperan dalam pertumbuhan dan ketahanan tanaman terhadap serangan patogen. Seperti spesies tanaman lain, padi yang merupakan makanan pokok penduduk dunia terutama Indonesia selama fase hidupnya juga dihuni oleh berbagai mikrob. Lingkungan filosfer tanaman padi dihuni oleh berbagai mikrob yang berperan dalam pertumbuhan dan ketahanan tanaman terhadap patogen seperti Pyricularia oryzae dan Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Peran penting bakteri filosfer padi tersebut mendorong eksplorasi agens biokontrol dari lingkungan filosfer padi untuk mengendalikan patogen penting pada padi. Beberapa tahun terakhir, penelitian tentang bakteri filosfer terbatas pada bakteri yang bisa dikulturkan dengan potensi sebagai agens biokontrol dan bakteri patogen yang menyerang bagian daun tanaman. Pengetahuan terkait keragaman bakteri filosfer khususnya di Indonesia masih sangat terbatas, sehingga pada penelitian ini dilakukan analisis keragaman bakteri filosfer dari tanaman padi yang diambil dari daerah Sukabumi, Jasinga dan Situgede, Bogor, Jawa Barat. Analisis keragaman dilakukan dengan metode T-RFLP dengan menggunakan 2 enzim restriksi untuk mengetahui keefektivan masing-masing enzim tersebut. Penelitian ini diawali dengan pengambilan sampel tanaman padi varietas Ciherang yang dibudidayakan di desa Cikembar, Sukabumi, desa Jasinga dan Situgede, Bogor yang merupakan daerah endemik penyakit blas. Tanaman padi sehat diambil di antara tanaman padi yang terserang penyakit blas. Isolasi bakteri filosfer dari sampel daun padi dilakukan untuk memperoleh genom bakteri dengan pendekatan pengkulturan, sedangkan untuk pendekatan metagenomik, genom bakteri filosfer diisolasi secara langsung dari sampel daun padi. Genom bakteri diekstraksi dengan Power Soil DNA Extraction Kit (Mo Bio Laboratories, Inc.). Gen 16S rRNA selanjutnya diamplifikasi dari genom bakteri menggunakan primer universal yaitu 27F berlabel fluoresens (6-FAM) dan 1429R tanpa label fluoresens. Amplikon gen 16S rRNA dipurifikasi dengan Gel/PCR DNA Fragments Kit (Geneaid Biotech Ltd.) dan hasil purifikasi dipotong dengan enzim restriksi MspI dan BstUI (New England, BioLab). Fragmen hasil pemotongan dianalisis dengan Applied Biosystems Genetic Analyzer dan diinterpretasi menggunakan software analisis GeneMapper® v4.0. Program virtual digest (IsPar) pada webtool MiCA III digunakan untuk mencari afiliasi setiap fragmen dengan data yang ada di Ribosomal Database Project (RDP) (R10 U27) 700,829 Good Qulity (> 1200 Bacteria). Hasil isolasi dan enumerasi bakteri filosfer padi menunjukkan bahwa kelimpahan bakteri filosfer padi berkisar antara 105 sampai 107 cfu/gram daun padi. Pada analisis keragaman bakteri dengan T-RFLP, pemotongan dengan enzim MspI menghasilkan lebih banyak TRF dibandingkan enzim BstUI baik pada pendekatan metagenomik maupun pengkulturan. Analisis afiliasi fragmen pada webtool MiCA III menghasilkan 15 kelompok bakteri dari 29 TRF hasil pemotongan dengan enzim MspI. Diantara 15 kelompok bakteri, Betaproteobacteria dan Pseudomonadales ditemukan di semua sampel tanaman padi baik pada fase vegetatif maupun generatif dengan kelimpahan relatif yang berbeda. Selain dua kelompok bakteri tersebut, juga ditemukan beberapa kelompok bakteri lain dengan kelimpahan relatif yang rendah seperti kelompok bakteri Chloroflexales, Sphingobacteriia, Enterobacteriales dan Epsilonproteobacteria. Setiap sampel memiliki komposisi komunitas bakteri filosfer yang berbeda-beda dengan kelimpahan relatif yang berbeda. Hasil analisis pengelompokan (clustering) diperoleh 2 kluster yang terdiri dari sampel padi Sukabumi (kluster 1) dan Bogor (kluster 2). Hasil analisis keragaman dan pengelompokan mengindikasikan bahwa faktor umur tanaman padi dan lokasi budidaya mempengaruhi keragaman bakteri filosfer. Diantara kedua faktor tersebut, lokasi geografis budidaya tanaman padi lebih berpengaruh terhadap keragaman bakteri filosfer dibandingkan umur tanaman padi.