Transformasi Genetik Kappaphycus alvarezii dengan Gen Gα Menggunakan Perantara Agrobacterium tumefaciens untuk Mendapatkan Toleransi Terhadap Hiposalin

Abstract

Kappaphycus alvarezii yang dikenal rumput laut Kotoni adalah jenis makro alga (Gigartinales, Rhodophyta) penghasil karaginan yang banyak digunakan di industri makanan, obat dan kosmetik. Kappaphycus alvarezii tumbuh dengan baik pada salinitas 28-34 ppt (part per thousand). Pada musim curah hujan yang tinggi, salinitas air laut turun menjadi di bawah 28 ppt sehingga menyebabkan rumput laut ini mengalami cekaman hiposalin dan mudah terkena penyakit. Solusi untuk mengatasi masalah ini adalah transformasi genetik K. alvarezii menggunakan gen Gα dengan perantara Agrobacterium tumefaciens untuk mendapatkan bibit unggul yang toleran terhadap cekaman hiposalin. Gen Gα menyandikan protein G subunit α merupakan protein membran yang berperan sebagai mediator yang mengirimkan sinyal ekstraseluler dari molekul reseptor di membran sel ke molekul efektor seperti enzim, saluran (channel) ion, dan efektor intraseluler lainnya di sitoplasma. Pensinyalan protein Gα berperan dalam regulasi saluran ion Ca2+ di membran plasma. Pada kondisi hiposalin, protein Gα dapat meningkatkan influx Ca2+ eksternal ke sitoplasma untuk memfasilitasi pemeliharaan homeostasis K+ dan Na+. Selain itu, Ca2+ juga berperan dalam mengurangi permeabilitas membran plasma terhadap ion lain, sehingga mengurangi kehilangan ion yang terjadi pada saat influx air ketika sel menghadapi cekaman hiposalin. Tujuan umum penelitian ini adalah transformasi genetik untuk mendapatkan plantlet K. alvarezii transgenik yang mengekpresikan secara berlebih (overexpression) gen Gα dan memiliki toleransi terhadap cekaman hiposalin. Pada penelitian tahap pertama, kalus K. alvarezii telah dikokultivasi dengan Agrobacterium tumefaciens LBA4404 atau EHA105 pembawa vektor ekspresi pGWB502-Gα dengan promotor kuat 35S CaMV dan gen resistensi terhadap higromisin. Kokultivasi dilakukan dengan perlakuan konsentrasi asetosiringon (0, 20, 40, 60 mg/L). Regenerasi kalus yang resistan higromisin menjadi plantlet transgenik telah berhasil dilakukan menggunakan teknik embriogenesis somatik. Efisiensi transformasi paling tinggi terdapat pada perlakuan asetosiringon 20-40 mg/L (22-28%). Efisiensi transformasi yang dihasilkan strain A. tumefaciens EHA105 (23%) tidak berbeda nyata dengan efisiensi transformasi yang dihasilkan strain LBA4404 (15%). Pada penelitian tahap kedua, satu klon plantlet nontransgenik dan enam klon plantlet transgenik dari penelitian sebelumnya diuji pertumbuhannya di media Provasoli enriched seawater (PES) dengan salinitas normal (30 ppt) dan hiposalin (15 dan 20 ppt) selama 5 minggu. Hasil penelitian menunjukkan LPH plantlet transgenik pada salinitas normal (2.1-3.4% h-1) dan salinitas 20 ppt (1.7-2.3% h-1) lebih tinggi dari LPH plantlet nontransgenik pada salinitas normal (1.4% h-1). Pada salinitas 15 ppt, seluruh plantlet transgenik masih hidup dan tumbuh dengan LPH berkisar antara 0.8-1.2% h-1, sedangkan talus plantlet nontransgenik mengalami bleaching dan mati sehingga LPH 0% h-1. v Adanya gen Gα dengan promotor kuat pada plantlet transgenik menyebabkan kandungan kalsium pada plantlet transgenik pada salinitas 30 ppt (2.49%) maupun hiposalin 20 ppt (5.97%) dan 15 ppt (9.27%) lebih tinggi dari kandungan kalsium plantlet nontransgenik pada salinitas normal (2.06%). Peningkatan kandungan kalsium telah meningkatkan rigiditas talus plantlet transgenik pada salinitas 15 ppt, hal ini kemungkinan disebabkan peningkatan rigiditas dinding sel untuk mengurangi influx air secara berlebihan ke dalam sitoplasma pada saat cekaman hiposalin. Peningkatan kandungan Ca juga dapat mengurangi permeabilitas membran plasma terhadap ion lain, sehingga mengurangi kehilangan ion pada saat terjadi influx air pada kondisi hiposalin. Hal-hal tersebut yang menyebabkan talus plantlet transgenik tidak bleaching dan tetap tumbuh pada salinitas 15 ppt. Pada penelitian tahap ketiga, analisis tingkat ekspresi gen Gα menggunakan teknik qRT-PCR (quantitative real time polymerase chain reaction) telah dilakukan pada dua klon plantlet transgenik yang toleran terhadap cekaman hiposalin hingga 15 ppt. Tingkat ekspresi gen dihitung berdasarkan pada ekspresi relatif gen Gα terhadap gen referensi (gen actin) menggunakan metode 2-ΔΔCt. Hasilnya menunjukkan bahwa plantlet transgenik yang toleran cekaman hiposalin mempunyai tingkat ekspresi gen Gα lebih tinggi 6.43-8.03 kali dibandingkan dengan pada plantlet nontransgenik. Hasil analisis korelasi sederhana menunjukkan ekspresi relatif gen Gα berkorelasi kuat dengan laju pertumbuhan harian plantlet pada salinitas 30 ppt, 20 ppt dan 15 ppt, korelasi bersifat linear positif. Berdasarkan hal ini maka dapat diketahui peningkatan laju pertumbuhan pada salinitas normal maupun hiposalin berhubungan dengan adanya ekspresi berlebih gen Gα pada plantlet transgenik. Simpulan umum dari hasil penelitian ini adalah transformasi genetik pada kalus K. alvarezii menggunakan gen Gα dengan perantara A. tumefaciens telah menghasilkan plantlet K. alvarezii transgenik yang mengekpresikan secara berlebih gen Gα dan memiliki pertumbuhan dan toleransi terhadap cekaman hiposalin lebih tinggi dibandingkan plantlet nontransgenik.