Identifikasi Gen NRAMP-1, iNOS dan TGF-β2 serta Asosiasinya dengan Sifat Ketahanan Infeksi pada Ayam Sentul

Abstract

Indonesia merupakan negara yang memiliki banyak jenis ayam. Berdasarkan penampilan fenotipik terdapat 27 rumpun ayam asli dan 14 rumpun ayam lokal yang dipelihara dengan sistem tradisional, semi intensif dan intensif. Ayam sentul merupakan salah satu rumpun ayam asli di Indonesia, yang awalnya dipelihara oleh penduduk desa di Kabupaten Ciamis, Jawa Barat. Program pemuliaan untuk sifat ketahanan infeksi dapat menjadi pendekatan yang efektif untuk mengendalikan agen infeksi pada ayam. Pendekatan genetik terhadap ketahanan infeksi pada ayam sangat penting, terutama untuk sistem produksi di negara-negara berkembang, karena umumnya sistem pemeliharaan masih tradisional atau semi intensif dan dengan skala kecil, dimana vaksinasi dan pengobatan sulit dilakukan dan mahal. Pendekatan kandidat gen merupakan metode yang bermanfaat untuk menyelidiki gen yang terlibat dalam ketahanan genetik. Pendekatan kandidat gen telah berhasil digunakan untuk mendeteksi gen yang penting untuk ketahanan infeksi pada ayam, termasuk gen natural resistance-associated macrophage protein 1 (NRAMP-1), inducible nitric oxide synthase (iNOS) dan transforming growth factor-beta 2 (TGF-β2). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi keragaman gen NRAMP-1, iNOS dan TGF-β2 pada ayam Indonesia dan untuk menganalisis asosiasi genotipe gen NRAMP-1, iNOS dan TGF-β2 dengan sifat ketahanan infeksi dan ekspresi gen NRAMP-1 dan iNOS pada ayam sentul. Penelitian ini terdiri dari tiga tahap. Tahap pertama adalah mengidentifikasi keragaman gen NRAMP-1, iNOS dan TGF-β2 pada rumpun ayam Indonesia dengan menggunakan metode PCR-RFLP. Tahap kedua adalah menganalisis asosiasi genotipe gen NRAMP-1, iNOS dan TGF-β2 dengan sifat ketahanan infeksi, seperti konsentrasi leukosit dan diferensiasinya (heterofil, limfosit dan monosit), aktivitas dan kapasitas makrofag dan clearance test. Tahap ketiga adalah menganalisis ekspresi gen NRAMP1 dan iNOS dengan menggunakan metode RT-PCR. Enzim restriksi SacI digunakan untuk memotong produk PCR pada NRAMP-1-SNP (g.3768T> C). Pemotongan dengan SacI menghasilkan tiga fragmen yang terdiri dari 421 bp, 258 bp dan 163 bp untuk genotipe TC; dua fragmen yang terdiri dari 258 dan 163 bp untuk genotipe CC; dan satu fragmen yang terdiri dari 421 bp untuk genotipe TT. Frekuensi genotipe CC lebih tinggi dari pada genotipe TT dan TC pada semua populasi ayam dalam penelitian ini. Konsentrasi leukosit dan diferensiasinya (heterofil, limfosit dan monosit) pada genotipe TT, TC, dan CC gen NRAMP-1 berada dalam kisaran normal pada ayam sentul. Analisis asosiasi menunjukkan keragaman gen NRAMP-1 secara signifikan berasosiasi dengan sifat ketahanan infeksi pada ayam sentul. Genotipe CC berasosiasi signifikan (P<0,05) dengan aktivitas makrofag (90.78±1.31%) dibandingkan genotipe TT (76.00±2.40%) dan TC (79.14±1.57%) pada ayam sentul. Genotipe TT, TC dan CC tidak berasosiasi signifikan dengan kapasitas makrofag (masing-masing, 22.49±6.13, 21.85±4.01, 21.76±3.36). Analisis asosiasi menunjukkan keragaman gen NRAMP-1 secara signifikan berasosiasi (P <0,05) dengan clearance test. Ayam sentul dengan genotipe CC memiliki clearance yang lebih tinggi (P <0,05) daripada ayam sentul dengan genotipe TT dan TC. Ekspresi gen genotipe CC pada gen NRAMP-1 lebih tinggi pada hati dan usus daripada genotipe TT dan TC. Analisis genotyping gen iNOS (g.15056T>C) dilakukan menggunakan enzim restriksi AluI. Hasil genotyping ini teridentifikasi dua alel (T dan C) dan tiga genotipe (TT, TC, dan CC). Alel C ditunjukkan oleh 310 dan 139 bp (restricted), sedangkan alel T ditunjukkan oleh 449 bp (unrestricted). Frekuensi genotipe CC dan alel C gen iNOS (g.15056T>C) paling dominan di semua populasi ayam dalam penelitian ini. Konsentrasi dan diferensiasi leukosit (heterofil, limfosit dan monosit) pada genotipe TT, TC, dan CC gen iNOS berada dalam kisaran normal pada ayam sentul. Analisis asosiasi menunjukkan keragaman gen iNOS secara signifikan berasosiasi dengan sifat ketahanan infeksi pada ayam sentul. Genotip CC secara signifikan berasosiasi (p <0,05) dengan aktivitas makrofag daripada genotipe TT dan TC pada ayam sentul. Tidak ada asosiasi signifikan yang ditemukan antara genotipe TT, TC dan CC dengan kapasitas makrofag. Analisis asosiasi menunjukkan asosiasi signifikan (P <0,05) dengan clearance test. Ayam sentul dengan genotipe CC memiliki clearance yang lebih tinggi (P <0,05) daripada ayam sentul dengan genotipe TT dan TC. Ekspresi gen pada genotipe CC gen iNOS lebih tinggi pada hati dan usus daripada genotipe TT dan TC. Analisis genotyping gen TGF-β2 (g.640T>C) dilakukan menggunakan enzim restriksi RsaI. Hasil genotyping ini teridentifikasi dua alel (T dan C) dan tiga genotipe (TT, TC, dan CC). Alel T ditunjukkan oleh 184 dan 100 bp (restricted), sedangkan alel C ditunjukkan oleh 284 bp (unrestricted). Frekuensi genotipe TT dan alel T gen TGF-β2 (g.640T>C) paling dominan di semua populasi ayam dalam penelitian ini. Konsentrasi dan diferensiasi leukosit (heterofil, limfosit dan monosit) pada genotipe TT, TC, dan CC gen TGF-β2 berada dalam kisaran normal pada ayam sentul. Analisis asosiasi menunjukkan keragaman gen TGF-β2 secara signifikan berasosiasi dengan sifat ketahanan infeksi pada ayam sentul. Genotipe TT secara signifikan berasosiasi (p <0.05) dengan aktivitas makrofag dan clearance test daripada genotipe TC dan CC pada ayam sentul. Kesimpulannya, gen NRAMP-1, iNOS dan TGF-β2 pada ayam sentul dan semua populasi ayam dalam penelitian ini bersifat polimorfik, dengan dua alel (T dan C) dan tiga genotipe (TT, TC, dan CC). Asosiasi keragaman gen NRAMP-1, iNOS dan TGF-β2 dengan sifat ketahanan infeksi ayam sentul telah dijelaskan untuk pertama kalinya, memberikan bukti bahwa gen NRAMP-1, iNOS dan TGF-β2 dapat menjadi kandidat gen penting untuk sifat ketahanan terhadap infeksi pada ayam. Namun, penelitian ini harus divalidasi pada populasi ayam lainnya untuk mengevaluasi potensinya dalam program pemuliaan selektif.