Karakterisasi Enzim dan Ekspresi Heterolog Endo-β-1,4-xilanase dari Streptomyces sp. 45I-3 pada Escherichia coli

Abstract

Endo-ß-1,4-xilanase (xilanase) merupakan enzim utama yang terlibat dalam hidrolisis xilan dengan cara mendepolimerisasi xilan melalui hidrolisis acak ikatan tulang punggung ß-1,4 menjadi xilooligosakarida dan xilosa. Berbagai mikrob dilaporkan mampu menghasilkan enzim xilanase. Eksplorasi enzim xilanase yang berasal dari bakteri semakin meningkat seiring dengan tingginya permintaan enzim ini dalam dunia industri. Bakteri dari genus Bacillus, cendawan dari genus Trichoderma dan Aspergillus, dan aktinobakteria dari genus Streptomyces diketahui merupakan mikrob potensial penghasil enzim xilanase. Analisis gen 16 sRNA isolat 45I-3 xilanolitik yang diisolasi dari sampel tanah rawa gambut di Kalimantan menunjukkan kedekatan terhadap Streptomyces costaricanus strain NBRC 100773 dengan kesamaan sebesar 99%. Isolat 45I-3 menunjukkan karakteristik morfologi koloni berbentuk hifa bulat, dengan tepian yang tidak rata dan permukaan yang bertepung, miselia substrat berwarna kuning sedangkan miselia aerial berwarna putih kekuningan dengan pigmentasi yang kuning terang pada media xilan beechwood, sedangkan pada media YMA, YSA, NA, PDA dan ISP4 miselia aerial berwarna coklat dan miselia substrat berwarna putih kekuningan sampai abu kecoklatan. Gambar mikroskopis dan foto Scanning Electron Microscope (SEM) menunjukkan karakter hifa fleoxous dengan morfologi spora tipe smooth. Optimasi produksi enzim xilanase ekstrak kasar dengan penambahan variasi jenis substrat, sumber karbon, nitrogen, dan fosfat menunjukkan bahwa penggunaan substrat xilan tongkol jagung mampu menghasilkan indeks enzimatik tertinggi (3.60) dibandingkan dengan substrat xilan beechwood (2.87), birchwood (2.8), oat spelt (2.77), dan xilan tembakau (2.08). Penambahan konsentrasi xilan beechwood 0-1.0% menunjukkan peningkatan aktivitas enzim xilanase seiring dengan penambahan konsentrasi xilan yang ditambahkan pada media produksi. Waktu produksi enzim xilanase terbaik diperoleh pada hari ke 8 dengan aktivitas sebesar 2.29 U/mL. Penggunaan variasi sumber fosfat menunjukkan bahwa, penggunaan natrium dihidrogen fosfat (NaH2PO4) merupakan sumber fosfat terbaik dengan aktivitas tertinggi (2.37 U/mL). Penggunaan variasi sumber nitrogen berbeda menunjukkan bahwa ammonium sulfat ((NH4)2S2O4) dan ekstrak khamir menghasilkan aktivitas yang lebih besar (2.36 U/mL) dibandingkan sumber nitrogen pepton (2.06 U/mL), ekstrak malt (1.87 U/mL), tripton (1.67 U/mL), dan ammonium persulfat (NH4)2S2O8 (0.2 U/mL). Penambahan surfaktan berpengaruh terhadap aktivitas xilanase yang dihasilkan. Penambahan SDS (0.146 U/mL) dan Tween 80 (0.428 U/mL) menunjukkan respon negatif berupa penurunan aktivitas enzim xilanase, sedangkan pada surfaktan Dimetilsulfoksida (DMSO) tidak menunjukkan penurunan aktivitas xilanase (2.457 U/mL) dibandingkan dengan perlakuan kontrol. Gen penyandi enzim xilanase dari Streptomyces sp. 45I-3 berhasil diamplifikasi menggunakan sepasang primer yang didesain berdasarkan hasil penelitian sebelumnya. Amplifikasi menggunakan mesin polymerase chains reaction (PCR) mendapatkan amplikon dengan panjang berkisar 1029 pb. Analisis ORF menujukkan bahwa ORF ini termasuk pada glikosil hidrolase famili 11 (GH11). Panjang gen xilanase 1029 pb menyandikan 342 asam amino termasuk 43 asam amino putative sinyal peptida. CDS xilanase (XynSc11) berhasil disubkloning pada plasmid pGEM-T Easy, dikloning pada plasmid pET15b(+), dan diekspresikan pada Escherichia coli BL21 (DE3). Ekspresi XynSc11 pada E.coli ditunjukkan dengan pita protein berukuran ~33.8 kDa. Induksi E. coli rekombinan menggunakan isopropil β-D-1- thiogalakto-piranosida (IPTG) pada berbagai kondisi suhu dan waktu inkubasi menunjukkan pengaruh pada peningkatan konsentrasi protein rekombinan. Konfirmasi pita protein dilakukan menggunakan analisis zimogram. Hasil zimogram menunjukkan bahwa pita protein rekombinan memiliki aktivitas dalam mendegradasi substrat xilan beechwood, ditandai dengan adanya zona bening disekeliling pita protein rekombinan. Sekuen asam amino penyusun enzim endo-β-1,4-xilanase putatif dari Streptomyces sp. 45I-3 menunjukkan kesamaan sebesar 95% terhadap gen penyandi enzim xilanase bacterium enrichment culture clone (Xyl8B8). Perbedaannya adalah pada penelitian ini gen penyandi enzim endo-β-1,4-xilanase (XynSc11) diamplifikasi dari bakteri yang dapat dikultur (culturable) sedangkan sekuen gen enzim endo-β-1,4-xilanase Xyl8B8 berasal dari bakteri yang tidak dapat dikultur (unculturable) dengan pendekatan pustaka genom. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa penggunaan inang E. coli pada ekspresi xilanase rekombinan XynSc11 terbukti mampu meningkatkan produktivitas enzim xilanase sebesar 48.73 kali lebih besar dibandingkan dengan produksi xilanase langsung dari kultur Streptomyces sp. 45I-3. Enzim xilanase rekombinan memiliki aktivitas sebesar 110.59 U/mL dengan aktivitas spesifik 1.644 U/mg pada suhu inkubasi 55 ⁰C dan pH 6.0. Enzim xilanase rekombinan memiliki aktivitas yang stabil pada suhu prainkubasi 45 ⁰C hingga menit ke-45, namun kurang stabil pada suhu prainkubasi 55 ⁰C dan 65 ⁰C.