Keragaman Genetik Ayam Asli Indonesia Yang Langka Berdasarkan Analisis Sekuen Komplit Daerah D-Loop Mitokondria Dan Gen Myxovyrus (Mx) Resistance

Abstract

Ayam bekisar (BkSr), bekikuk (BKK), leher gundul (GUN), sumatera (SUM) dan walik (WLK) merupakan ayam asli Indonesia yang langka. Karakter molekuler merupakan salah satu kriteria standar teknis utama dalam penetapan rumpun (breed) dan galur ayam di Indonesia yang sampai saat ini masih terbatas datanya. Wabah penyakit viral seperti AI dan ND juga diperkirakan menjadi salah satu penyebab kelangkaan dan hilangnya breed ayam sehingga karakteristik gen yang terkait dengan tingkat kekebalan tubuh ayam terhadap serangan penyakit akan menentukan keberlangsungan hidup ayam. Tujuan penelitian ini adalah untuk menyediakan pangkalan data struktur populasi dan diferensiasi breed dan menduga asal-usul ayam asli Indonesia berdasarkan karakteristik mtDNA d-loop dan gen Mx. Penelitian ini terdiri dari 2 tahapan penelitian yaitu (1). Determinasi breed ayam asli Indonesia yang langka dan ayam Indonesia yang lain berdasarkan analisis sekuen komplit daerah d-loop mitokondria (mtdna d-loop), dan (2). variasi dan evolusi gen Mx ayam berdasarkan sejarah program seleksi dan pembentukan breed ayam. Penelitian ini menggunakan 23 breed ayam Indonesia (mewakili 35% jumlah total breed ayam yang ada di Indonesia), berdasarkan Sartika dan Iskandar (2007). Tiga set data digunakan pada penelitian tahap 1. Data pertama digunakan untuk menentukan haplogroup mtDNA d-loop ayam asli Indonesia dan hubungannya dengan ayam-ayam dari negara-negara lain dengan menggunakan analisis unrooted neighbor-joining (NJ). Data pertama ini terdiri dari 679 sekuen mtDNA d-loop (1227 bp) dari 6 breed ayam asli Indonesia yang langka (BkSr, Bkk, BRG, GUN, SUM dari populasi Indonesia dan Amerika Utara dan WLK), 17 breed ayam Indonesia yang lain (arab golden red ARGj dan ARGb, arab silver ARGs, bangkok BgK, black java (BJ, dari populasi Amerika Utara), cemani CMN, gaga’ GAG, kampung (KPGb, KPGb, KPGg, KPGbd, KPGs dan KPGsl), kate KT, kapas KPS, kedu hitam KDh, kedu lurik KDl, kedu putih KDp, kukuak balenggek AKB, pelung PLg, nunukan NNK, sentul STL, dan serama SRM, 2 ayam ras komersial (broiler BRO, dan layer L), 5 subspesies ayam hutan hijau (dari Bali AHHb, Jawa AHHj, dan Madura AHHm) dan 2 ayam hutan merah (dari Jawa AHMj, dan Sumatera AHMs) dan 154 sekuen perwakilan haplotype mtDNA d-loop ayam di dunia (A-I dan W-Y) (Mioa et al. 2013). Seratus sembilan puluh delapan (198) sekuen mtDNA D-loop ayam asli Indonesia dan ayam hutan telah disimpan di Genbank NCBI dengan no aksesi KR535995-KR536177 dan KT853000-KT853016. Data kedua terdiri dari 524 sekuen mtDNA D-loop (1227 bp) ayam Indonesia dan ayam hutan digunakan untuk memperkirakan struktur populasi dan determinasi spesies, subspecies, breed dan galur ayam. Keragaman haplotype (H) dan keragaman genetik (π) mtDNA d-loop dari 481 individu ayam Indonesia dan ayam ras komersial dihitung dengan menggunakan program DNA Sequence Polymorphism (DnaSP) versi 5.10.01. Struktur populasi dan determinasi breed ayam dianalisis dengan menggunakan program Mr. Bayes versi 3.0. Data ketiga mencakup 616 sekuen mtDNA D-loop ayam (ayam Indonesia=490; ayam dari luar negeri=126) yang digunakan untuk menganalisis aliran genetik dan penyebaran ayam yang dianalisis dengan menggunakan Median Joining Network (MJ) dalam program NETWORK versi 5.0.0.0. Penyebaran ayam berdasarkan 7 wilayah regional State of the World’s Animal Genetic Resources for Food and Agriculture (SoW-AnGR) yang ditetapkan FAO (2007) digunakan untuk menentukan pengelompokan breed ayam: (1). lokal (breed yang hanya ada di 1 negara), (2). lintas batas regional (breed lintas batas yang hanya ada di salah satu di antara 7 wilayah regional SoW-AnGR) dan (3). lintas batas internasional (breed yang ada di lebih dari 1 wilayah regional SoW-AnGR). Hasil penelitian tahap 1 menunjukkan bahwa ayam asli Indonesia yang langka (BkSr, BRG, SUM, GUN dan WLK) memiliki rataan keragaman genetik yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan ayam yang lain. Penanda mtDNA d-loop dapat digunakan untuk membedakan subspecies ayam hutan dan breed pada ayam Indonesia. Sebanyak 201 haplotype teridentifikasi pada penelitian ini. Ayam asli Indonesia yang langka mengelompok pada haplogroup B, D dan E (terutama D). Ayam Indonesia pada awalnya dikembangkan untuk tujuan hiburan (pesuara dan hias), selanjutnya diseleksi sebagai ayam pedaging dan petelur. Pendugaan hubungan kekerabatan yang dekat antara BJ dan BS dari USA (haplogroup E) dengan SUM dan KDh (haplogroup D) tidak terbukti pada penelitian ini. Penelitian ini mengusulkan 5 haplogroup baru untuk determinasi subspesies ayam hutan: Vm, Vj dan Vb (masing-masing untuk AHHb, AHHj dan AHHm), dan haplogroup J dan Sm (masing-masing untuk AHMj dan AHMs). Kontribusi AHH dan AHM dan asal-usul multiphyletic ayam asli Indonesia telah berhasil dijelaskan dalam penelitian ini. Tiga aliran mtDNA D-loop ayam yang menentukan asal-usul ayam Indonesia yaitu: (1) Cina, India, Jepang dan Korea, (2). Bangladesh, Cina, India, Jepang, Korea, Laos, Myanmar dan Thailand dan (3). Afrika, Bangladesh, Cina, India, Jepang, Korea, Mediterania dan USA. Tiga (3) breed ayam Indonesia (KDl, KPG dan SUM) diduga sebagai breed ayam asli yang hanya ada di Indonesia. Oleh karena itu, pelestariannya sangat penting untuk dilakukan sebagai upaya untuk mempertahankan keragaman genetik dan juga untuk pemanfaatannya di masa depan. Pembentukan galur murni ayam Indonesia seharusnya didukung oleh oleh program seleksi dan pemuliaan yang sistematis. Pada penelitian tahap 2 digunakan 216 individu ayam dari penelitian tahap 1 yang dikelompokkan berdasarkan tingkat seleksi dan program pemuliaan, yaitu: (1). Liar 1 (AHH), (2). Liar 2 (AHM), (3). Unselected chicken (UC), (4). Moderately selected chicken (MC) dan (5). Highly selected chicken (HC). Total 216 sekuen gen Mx ayam (daerah promotor dan ekson 1-14) digunakan untuk menganalisis struktur populasi dan pengaruh sejarah seleksi dan pembentukan breed ayam terhadap evolusi gen Mx ayam. Nilai H dan h dihitung berdasarkan Nei (1987) dengan menggunakan program DnaSP versi 5.10.00. Frekuensi diplotype, perbandingan pairwise indeks fiksasi (FST), diferensiasi allel dan molecular variance analysis (AMOVA) kelompok L1, L2, UC, MC dan HC dihitung dengan menggunakan program Arlequin v3.5.1.2. Analisis Bayesian dengan menggunakan program Mr. Bayes versi 3.0 digunakan untuk menduga hubungan kedekatan gen Mx masing-masing breed ayam. Analysis of variance (ANOVA) selanjutnya dilakukan untuk menganalisis hubungan antara genotipe gen Mx (alel resisten A/A, dan alel rentan A/G and G/) dengan respon kekebalan ayam Indonesia (nilai titer antibodi HI ayam terhadap NDV dan H5N1 AIV). Hasil penelitian tahap 2 menemukan 127 SNPs baru pada gen Mx ayam termasuk nonsynonomious S631N. Sebanyak 779 asam amino diprediksikan membentuk protein Mx ayam Indonesia dan ayam hutan. Ayam pada kelompok UC mempunyai keragaman gen Mx lebih tinggi (p<0.05) jika dibandingkan dengan ayam pada kelompok MC dan HC. Tiga tipe mutasi nukleotida pada ekson 14 gen Mx ayam terdeteksi pada penelitian ini, yaitu (1). Tipe liar (W) pada kelompok HC, (2). Tipe mutasi splice-site 1 (SS1) pada kelompok UC, MC, L1 dan L2, dan (3). Tipe mutasi splice-site 2 (SS2) pada kelompok UC, MC, L1 dan L2. Hilangnya 3 dan 32 basa nukleotida dari ekson 14 gen Mx masing-masing pada mutan SS1 dan mutan W, menghasilkan hilangnya 1 dan 8 asam amino pada ekson 14 gen Mx sehingga membentuk protein Mx yang tidak normal. Tipe mutan SS2 diperkirakan sebagai karakteristik origin dari gen Mx ayam hutan dan ayam asli Indonesia. Alel resisten A/A juga menunjukkan respon kekebalan negatif terhadap H5N1AIV dan NDV. Penggunaan alel A dari gen Mx ayam untuk meningkatkan kekebalan tubuh ayam terhadap berbagai jenis antigen (terutama AIV dan NDV) belum dapat disarankan dalam penelitian ini. Penanda gen Mx dapat digunakan untuk membedakan subspesies ayam hutan dan breed ayam asli Indonesia. Diplogroup gen Mx AHM mengelompok dengan diplogroup gen Mx ayam Indonesia. Ayam hitam dari USA (BJ dan BS) juga diduga tidak berkerabat dekat dengan KDh dan SUM. Kontribusi AHH dalam domestikasi ayam asli Indonesia diperkirakan melalui pembentukan BkSr yang memiliki diplotype gen Mx yang sama dengan ayam asli Indonesia yang lain. Penelitian ini mengusulkan diferensiasi breed dan galur ayam Indonesia yang baru. Penanda mtDNA d-loop dapat digunakan untuk menduga analisis kekerabatan maternal, sedangkan penanda gen Mx dapat digunakan secara parsial atau bersama-sama dengan mtDNA d-loop untuk tujuan analisis kekerabatan yang spesifik saat ini. Penelitian ini menyediakan data penting tentang karakteristik molekuler ayam asli Indonesia dalam rangka mendukung Peraturan Menteri Pertanian Republik Indonesia Nomor: 117/Permentan/SR.120/10/2014 tentang penetapan dan pelepasan rumpun atau galur hewan).