Identifikasi Dan Desain Primer Diferensial Dua Begomovirus Pada Mentimun Di Jawa Barat Dan Bali

Abstract

Mentimun (Cucumis sativus L.; Cucurbitaceae) merupakan salah satu jenis sayuran penting di Indonesia. Salah satu pembatas produksinya adalah infeksi Begomovirus. Beberapa Begomovirus yang menyebabkan penyakit penting secara ekonomis di Indonesia, diantaranya Pepper yellow leaf curl Indonesia virus (PYLCIV) pada cabai, Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) pada tomat, dan Mungbean yellow mosaic India virus (MYMIV) pada kacang panjang, dan pada mentimun disebabkan oleh Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) di Klaten (Jawa Tengah) dan Squash leaf curl China virus (SLCCNV) di Tabanan (Bali). Kedua Begomovirus pada mentimun ini dapat menginfeksi secara tunggal maupun ganda di lapangan dengan gejala yang hampir sama, sehingga diagnosis virus berdasarkan gejala sulit menentukan virus penyebabnya. Oleh karena belum diketahui insidensi dan penyebaran kedua virus pada mentimun khususnya di Jawa Barat dan Bali maka perlu dilakukan penelitian terkait deteksi dan identifikasi Begomovirus pada mentimun dan penyediaan primer diferensial yang dapat membedakan kedua virus dengan cepat dalam PCR tunggal. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan insidensi penyakit kuning oleh Begomovirus pada tanaman mentimun di provinsi Jawa Barat dan Bali, dan mendesain serta menguji primer diferensial yang mampu mendeteksi dan membedakan dua spesies Begomovirus pada tanaman mentimun. Penelitian meliputi pengumpulan sampel tanaman mentimun, penentuan insidensi dua Begomovirus secara serologi dengan DIBA, identifikasi Begomovirus dengan PCR dan perunutan DNA, desain primer diferensial ToLCNDV dan SLCCNV, dan evaluasi primer diferensial melalui PCR unipleks maupun dupleks. Pengamatan gejala dan koleksi sampel terinfeksi Begomovirus diambil dari daerah Jawa Barat (Sumedang, Sukabumi, Karawang) dan Bali (Tabanan, Klungkung, Gianyar). Gejala yang umum ditemukan di lahan antara lain daun klorosis, mosaik kuning kehijauan, melepuh, daun menguning disertai penebalan tulang daun (vein banding), tepian daun menggulung kearah atas, dan kerdil. Hasil deteksi serologi menunjukkan bahwa gejala tersebut disebabkan oleh infeksi ToLCNDV dan Squash leaf curl virus (SLCV). Seluruh lahan pengambilan sampel didominasi oleh infeksi ToLCNDV, dengan insidensi penyakit berkisar 28% sampai dengan 100%. SLCV terdeteksi pada pertanaman mentimun di Bali dengan insidensi penyakit berkisar 42% sampai dengan 80% dan di Jawa Barat yaitu di Karawang sebesar 56% dan Sumedang sebesar 30%. Infeksi ganda antara ToLCNDV dan SLCV terdeteksi pada 7 dari 11 pertanaman mentimun yang diamati. Deteksi molekuler berhasil dilakukan terhadap enam isolat Begomovirus menggunakan pasangan primer universal pAV2048/pAC494 yang mengamplifikasi gen protein selubung dengan amplikon berukuran ±550 pb. Analisis runutan nukleotida gen protein selubung menunjukkan terdapat tiga spesies Begomovirus yang menginfeksi pertanaman mentimun di Jawa Barat dan Bali yaitu ToLCNDV, SLCCNV, dan Ageratum yellows vein virus (AYVV). Isolat Klungkung, Karawang, Sukabumi, dan Sumedang memiliki homologi nukleotida tertinggi dengan isolat ToLCNDV asal Klaten, Indonesia (AB613825), dengan homologi sebesar 97.3%, 97.0%, 96.3%, dan 97.2%. Keempat isolat ToLCNDV ini termasuk ke dalam ToLCNDV strain “Indonesia”. Isolat Tabanan, Bali memiliki homologi nukleotida tertinggi sebesar 94.5% dengan isolat SLCCNV asal Malaysia (EF197940) dan termasuk ke dalam SLCCNV strain “Cina”. Analisis nukleotida menunjukkan bahwa isolat Gianyar, Bali memiliki homologi nukleotida tertinggi sebesar 92.1% dengan AYVV asal Indonesia (AB100305) yang menginfeksi tanaman Nicotiana benthamiana. Primer diferensial untuk membedakan dua Begomovirus pada tanaman mentimun berhasil dibuat menggunakan metode semi-manual OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator. Pasangan primer T-2F/TS-2R digunakan untuk mengamplifikasi common region (CR) ToLCNDV dengan amplikon berukuran ± 600 pb, sedangkan pasangan primer S-2F/TS-2R mengamplifikasi CR-SLCCNV dengan amplikon berukuran ± 550 pb. Kedua primer tersebut berhasil mendeteksi ToLCNDV dan SLCCNV isolat Bali dengan baik melalui PCR unipleks maupun dupleks. Konfirmasi hasil deteksi melalui perunutan DNA dengan kedua primer dilakukan pada isolat dari Karawang dan Tabanan yang terdeteksi positif terhadap antiserum SLCV. Hasilnya menunjukkan bahwa DNA yang berukuran ± 550 pb teridentifikasi sebagai ToLCNDV pada isolat Karawang dan SLCCNV pada isolate Tabanan. Primer T-2F/S-2F/TS-2R mungkin dapat dimanfaatkan untuk deteksi cepat ToLCNDV dan SLCCNV dalam satu reaksi PCR. Namun, primer S-2F/TS-2R terindikasi masih kurang spesifik karena masih mampu mendeteksi ToLCNDV atau infeksi ganda ToLCNDV dan SLCCNV, maka dianjurkan hasil deteksi dikonfirmasi dengan perunutan DNA. Primer diferensial T-2F/S-2F/TS-2R dapat dimanfaatkan dalam deteksi awal ToLCNDV dan SLCCNV sebagai upaya pengendalian penyakit kuning pada tanaman mentimun di lapangan. Primer diferensial ini dapat digunakan secara simultan untuk deteksi infeksi ganda ToLCNDV dan SLCCNV menggunakan metode PCR dupleks. PCR dupleks menggunakan primer diferensial menyediakan suatu metode diagnosis yang cepat, sensitif, dan efisien.