Identifikasi Dan Mekanisme Komponen Bioaktif Ekstrak Daun Torbangun (Plectranthus Amboinicus (Lour.) Spreng) Sebagai Antioksidan Dan Fungsi Laktasi Pada Sel Epitel Kelenjar Susu Manusia Secara In Vitro”.

Abstract

Torbangun (Plectranthus amboinicus (Lour). Spreng) adalah tanaman herba yang termasuk dalam famili Lamiaceae. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsumsi daun torbangun (DT) dapat meningkatkan produksi air susu ibu (ASI). Produksi ASI merupakan proses yang komplek dan melibatkan berbagai hormon yang telah dimulai sejak kehamilan. DT mengandung berbagai senyawa bioaktif dan sejauh ini belum diketahui bagaimana mekanisme komponen bioaktif dalam DT meningkatkan kinerja laktasi. Komponen bioaktif DT dihipotesakan berperan dalam proses proliferasi sel atau diferensiasi sel atau sintesis komponen susu atau ketiganya sekaligus. Oleh karena itu diperlukan studi untuk melihat mekanisme komponen bioaktif DT dalam mempengaruhi proses laktasi di tingkat seluler. Selain dapat meningkatkan ASI, DT memiliki kemampuan sebagai antioksidan. Belum diketahui, apakah komponen bioaktif dalam DT yang berpotensi memodifikasi fungsi laktasi juga merupakan komponen yang berperan sebagai antioksidan. Penentuan komponen bioaktif tanaman dapat dilakukan dengan pendekatan metabolomik sebagai metode yang lebih efisien dan cepat dalam mengidentifikasi komponen bioaktif dalam suatu tanaman yang memiliki aktivitas biologi. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi komponen bioaktif DT sebagai antioksidan dan mekanismenya dalam meningkatkan produksi ASI. Tujuan khusus penelitian ini adalah : 1) mengarakterisasi sifat kimia esktrak DT, 2) mengidentifikasi komponen bioaktif ekstrak DT yang berfungsi sebagai antioksidan dengan pendekatan metabolomik, dan 3) menguji pengaruh fraksi bioaktif DT terhadap produksi prolaktin dan interaksinya dengan marka molekuler jalur Jak2/STAT5A sebagai marka regulasi proses laktasi di tingkat seluler menggunakan kultur sel epitel kelenjar susu manusia. Penelitian ini merupakan satu rangkaian penelitian, yang terdiri dari 4 tahap. Tahap pertama adalah ekstraksi dan fraksinasi ekstrak DT. Tahap kedua adalah karakterisasi sifat kimia ekstrak dan fraksi DT. Tahap ketiga adalah identifikasi senyawa bioaktif yang berfungsi sebagai antioksidan dalam ekstrak DT dengan pendekatan metabolomik menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Tahap keempat adalah melihat mekanisme ekstrak DT dalam mempengaruhi marka regulasi produksi ASI ditingkat molekuler dengan menguji ekstrak dan fraksi DT terhadap ekspresi gen-gen yang berhubungan dengan fungsi laktasi. Hasil ekstraksi dan fraksinasi bertingkat DT menghasilkan ekstrak metanol, fraksi n-heksana, fraksi kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air. Ekstrak metanol DT mengandung komponen fenolik, flavonoid, tanin, saponin, steroid, tetapi tidak mengandung alkaloid, triterpenoid dan hidroquinon. Setelah difraksinasi komponen fenolik, flavonoid dan tanin banyak terdapat pada fraksi etil asetat dan air, komponen steroid banyak pada fraksi n-heksana dan komponen saponin banyak ditemukan pada fraksi air. Kandungan senyawa fenol dalam ekstrak dan fraksi DT berkisar antara 44.97-429.81 mg AGE/g ekstrak. Total fenol dalam ekstrak dan fraksi DT dari yang tertinggi sampai terendah secara berurutan adalah fraksi etil asetat> fraksi air> ekstrak metanol> fraksi kloroform> fraksi n-heksana. Kandungan senyawa flavonoid dalam ekstrak dan fraksi DT berkisar antara 48.82- 89.85 mg QE/g ekstrak. Komponen flavonoid dalam ekstrak dan fraksi DT dari yang tertinggi sampai terendah secara berurutan adalah fraksi etil asetat> fraksi n-heksana> ekstrak metanol> fraksi kloroform> fraksi air. Aktivitas antioksidan tertinggi dihasilkan oleh fraksi etil asetat. Pada konsentrasi 12.5 μg/ml fraksi etil asetat dapat menangkap 93 % radikal bebas DPPH, sedangkan fraksi air 48.93 %, ekstrak metanol 43.9 % dan fraksi kloroform 12.41 %. Fraksi n-heksana memiliki kemampuan aktivitas antioksidan yang paling rendah dibandingkan fraksi lainnya. Fraksi n-heksana menghambat 93.29 % radikal bebas DPPH pada konsentrasi 500 μg/ml. Nilai EC50 dari fraksi DT berkisar antara 4.40–107.24 μg/ml. Nilai EC50 fraksi DT dari yang terendah sampai tertinggi secara berurutan adalah fraksi etil asetat< fraksi air< fraksi kloroform < fraksi n-heksana. Semakin rendah nilai EC50 semakin tinggi aktivitas antioksidannya. Nilai EC50 dari fraksi DT yang didapat masih diatas nilai EC50 standar antioksidan vitamin C (EC50 0.99 μg/ml) dan quersetin (EC50 1.73 μg/ml), tetapi untuk fraksi etil asetat dan air DT memiliki nilai EC50 yang lebih rendah dibandingkan dengan aktivitas antioksidan standar BHT (EC50 19.40 μg/ml). Berdasarkan pendekatan metabolomik, senyawa yang paling aktif sebagai antioksidan dalam ekstrak DT adalah asam rosmarinat. Senyawa ini paling banyak ditemukan pada fraksi etil asetat dan air, sangat sedikit pada fraksi kloroform dan n-heksana. Konsentrasi ekstrak DT yang digunakan sangat mempengaruhi jumlah sel MCF-12A yang hidup. Pada konsentrasi rendah (7.81 μg/ml) jumlah sel yang hidup pasca perlakuan semua ekstrak adalah 100 %. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak DT pada konsentrasi rendah tidak bersifat toksik terhadap sel MCF-12A. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak dan fraksi DT semakin sedikit jumlah sel yang hidup. Pada konsentrasi 62.5 μg/ml, jumlah sel yang hidup pada fraksi n-heksana dan kloroform menurun drastis menjadi 36 dan 38 %, sedangkan pada fraksi etil asetat dan air masih diatas 80 %. Nilai IC50 ekstrak dan fraksi DT dari berkisar antara 60.11 - 279.12 μg/ml. Semakin rendah nilai IC50, semakin toksik suatu senyawa. Nilai IC50 ekstrak dan fraksi DT dari yang terendah sampai tertinggi secara berurutan adalah fraksi n-heksana< fraksi kloroform< ekstrak metanol< fraksi etil asetat. Perlakuan fraksi air dengan konsentrasi 1000 μg/ml jumlah sel hidup diatas 50 % sehingga tidak dihitung nilai IC50nya. Berdasarkan nilai IC50 ini ekstrak dan fraksi DT tidak berpotensi toksik terhadap sel MCF-12A. Ekstrak dan fraksi DT meningkatkan produksi prolaktin pada sel MCF- 12A. Prduksi prolaktin tertinggi dihasilkan oleh fraksi etil asetat DT. Ditingkat seluler, yaitu pada sel epitel kelenjar susu manusia, fraksi dan ekstrak DT meningkatkan ekspresi gen-gen yang memiliki peranan dalam regulasi fungsi laktasi yaitu PRLR, GR, STAT5A dan β-kasein (CSN2). Fraksi air, kloroform, dan ekstrak metanol DT meningkatkan ekspresi mRNA PRLR masing-masing 1.5, 1.4 dan 1.2 kali lipat dibandingkan kontrol. Fraksi air, etil asetat dan ekstrak metanol DT meningkatkan ekspresi mRNA GR masing-masing 1.7, 1.3 dan 1.2 kali lipat dibandingkan kontrol. Semua fraksi dari ekstrak DT meningkatkan ekspresi mRNA STAT5A pada sel MCF-12A dibandingkan dengan kontrol. Peningkatan tertinggi terjadi pada fraksi kloroform, yakni 2.6 kali lipat, diikuti oleh fraksi air (2 kali lipat), fraksi n-heksana (1.8 kali lipat), ekstrak metanol (1.5 kali lipat) dan terendah adalah pada fraksi etil asetat (1.4 kali lipat). Fraksi etil asetat dapat meningkatkan ekspresi mRNA CSN2 menjadi 3.9 kali lipat dan fraksi air meningkatkan sebesar 1.5 kali lipat dibandingkan kontrol. Hasil studi mengindikasikan bahwa ekstrak DT meningkatkan ekspresi mRNA CSN2 melalui peningkatan ekspresi mRNA STAT5A dan GR. Berdasarkan hasil penelitian dapat diambil kesimpulan asam rosmarinat adalah senyawa yang diduga yang paling berperan sebagai antioksidan dalam ekstrak DT. Ekstrak dan fraksi DT mempengaruhi ekspresi gen yang berhubungan dengan fungsi laktasi pada sel epitel kelenjar susu manusia MCF-12A yaitu PRLR, GR, STAT5A dan CSN2. Fraksi etil asetat DT memiliki nilai komponen fenolik, flavonoid, aktivitas antioksidan, konsentrasi prolaktin dan ekspresi mRNA CSN2 yang paling tinggi dibandingkan dengan fraksi lainnya.