Carnation Mottle Virus Pada Tanaman Anyelir Di Indonesia: Etiologi, Ekspresi Gen Protein Selubung, Dan Eliminasinya

Abstract

Anyelir (Dianthus caryophillus L) merupakan salah satu tanaman bunga potong utama dunia karena bunganya cantik dan memiliki berbagai variasi warna dan bentuk. Di Indonesia, produksi bunga potong anyelir masih jauh dari potensi genetiknya, sehingga pendapatan petani dari usaha budidaya tanaman hias juga lebih rendah dari yang seharusnya. Kondisi ini terjadi karena hampir semua tanaman anyelir sudah terinfeksi virus, namun petani tidak mengetahui hal ini. Ada lebih dari 15 virus yang dapat menginfeksi anyelir, akan tetapi Carnation mottle virus (CarMV) dilaporkan merupakan virus utama pada tanaman anyelir. Di beberapa sentra produksi anyelir di Jawa Barat ditemukan gejala tanaman anyelir terinfeksi virus berupa belang-belang hijau tua dan muda (mottle). Gejala ini mirip dengan yang dilaporkan di luar negeri. Penelitian mengenai penyakit mottle/belang pada tanaman anyelir di Indonesia belum banyak dilakukan. Berdasarkan hal tersebut maka penelitian ini secara umum bertujuan untuk mengidentifikasi dan mendapatkan karakter virus penyebab penyakit belang pada tanaman anyelir di Jawa Barat serta memperoleh metode eliminasi virus untuk mendukung pengadaan benih anyelir secara berkelanjutan. Deteksi secara serologi menggunakan metode ELISA menunjukkan bahwa semua kultivar tanaman anyelir yang diuji (28 kultivar) terinfeksi oleh CarMV (100%) dan tidak terinfeksi oleh Carnation latent virus (CLV), Carnation ringspot virus (CRSV), dan Carnation vein mottle virus (CVMV). CarMV menginfeksi secara tunggal pada sampel tanaman anyelir yang diuji. Reaksi positif terhadap antiserum CarMV tidak hanya terjadi pada sampel tanaman yang bergejala saja tetapi juga pada sampel yang tidak bergejala. Partikel virus dari sap tanaman sakit berbentuk isometrik dengan diameter berukuran 30 nm teramati melalui pengecatan negatif 2% uranil asetat menggunakan transmission electron microscopy (TEM). RT-PCR dengan primer spesifik protein selubung (coat protein/CP) CarMV berhasil mengamplifikasi sembilan isolat gen CP CarMV dengan ukuran sekitar ± 1000 pb. Kesembilan CarMV asal Jawa Barat memiliki kesamaan runutan nukleotida berkisar 94.3% sampai 98.1% dan asam amino yang tinggi berkisar 95.5% sampai 99.4% dengan isolat-isolat dari negara lain yang. CarMV isolatisolat Jawa Barat memiliki kesamaan urutan nukleotida tertinggi dengan isolat CarMV asal China (AF173879) dan Spanyol (AJ309509.1), dan kesamaan asam amino tertinggi dengan isolat CarMV asal China dan Mexico (KC834739.1). Diantara sembilan isolat CarMV asal Jawa Barat, isolat CWB (Ciwangun dengan gejala berat) sudah didaftarkan di GenBank dengan nomor aksesi KP119181 dengan nama isolat Idn-WJ4. Alignment runutan nukleotida gen CP sembilan isolat CarMV asal Jawa Barat dengan sepuluh runutan nukleotida gen CP isolat dari negara lain menunjukkan bahwa pada isolat-isolat dari Jawa Barat terjadi mutasi tititk pada beberapa posisi nukleotida. Beberapa mutasi titik menyebabkan perubahan pada asam amino yang disandi dan motif protein yang dihasilkan. Keragaman genetik gen CP CarMV berkorelasi dengan variasi gejala pada tanaman anyelir terinfeksi. Analisis pohon filogenetik menunjukkan bahwa CarMV isolat-isolat Jawa Barat terpisah dalam tiga kelompok besar bersama-sama dengan isolat-isolat lainnya yang sudah terdaftar di Genbank. Deteksi virus yang mudah dan cepat, diperlukan untuk memantau sumber induk anyelir bebas virus. Metode simple direct tube (SDT) dan simple extraction method (SEM) berhasil mendapatkan RNA total dari tanaman anyelir baik dari sampel daun maupun batang. Metode ekstraksi RNA total dengan SDT dan SEM yang digabungkan dengan One step RT-PCR menghasilkan intensitas DNA yang sebanding dengan kit komersial. RNA total dari daun sebagai sumber templat one step RT-PCR terbaik dibandingkan batang. Preparasi RNA total dengan metode SDT dan SEM adalah metode cepat, mudah, dan murah dalam menyediakan templat one step RT-PCR. Konsentrasi primer 0.4 μM dan MgCl2 2 mM merupakan konsentrasi optimum untuk menghasilkan hasil amplifikasi terbaik. Gen CP parsial CarMV berukuran 1020 pb berhasil dikloning ke dalam TA vektor pTZ57R/T dan di subkloning ke vektor ekspresi pET28a, serta diekspresikan dalam bakteri E. coli strain BL21(DE3). Ekspektasi gen CP CarMV dalam vektor ekspresi menghasilkan protein fusi berukuran ± 40.2 kDa. Hasil analisis SDS PAGE menunjukkan adanya pita protein fusi pada ukuran ±40.2 kDa sebagai ekspresi dari gen CP CarMV rekombinan walaupun dengan tingkat ekspresi yang belum optimal. Untuk mendapat protein dalam jumlah melimpah (over expression) perlu dilakukan optimasi terhadap beberapa faktor yang dapat mempengaruhi ekspresi gen. CarMV dapat dibebaskan dari jaringan tanaman anyelir terinfeksi menggunakan antiviral 2-thiouracil dan amantadin. Kultur meristem terminal dari planlet pada perlakuan 2 thiourasil menghasilkan planlet bebas virus sebesar 0 sampai 57%, sementara perlakuan amantadin menghasilkan 25.0 sampai 54.55% planlet bebas virus. Diantara perlakuan yang diuji, perlakuan antiviral amantadin dengan konsentrasi 5 – 30 ppm lebih optimal menghasilkan planlet anyelir bebas CarMV dan tidak toksik terhadap tanaman. Perlakuan amantadin 5 sampai 20 ppm mampu menghambat virus lebih tinggi dibandingkan perlakuan 2-thiouracil pada konsentrasi yang sama. Amantadin 5 sampai 30 ppm menghasilkan tingkat penghambatan virus sebesar 42.94 – 59.57%, sedangkan 2-thiouracil sebesar -8.18 - 63,03%. Berdasarkan hasil tersebut amantadin lebih efektif diaplikasikan untuk mendapatkan tanaman anyelir bebas virus dibandingkan 2-thiouracil. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa penyakit belang pada tanaman anyelir di Jawa Barat disebabkan infeksi CarMV. Keberadaan CarMV dalam jaringan tanaman anyelir dapat dideteksi secara cepat menggunakan teknik one step RT-PCR menggunakan templat yang diekstraksi melalui metode SDT dan SEM. Gen CP CarMV dapat dikloning ke dalam TA vektor dan disubkloning ke dalam vektor ekspresi serta diekspresikan dalam bakteri ekspresi untuk menghasilkan antigen yang bermanfaat dalam pembuatan antiserum. CarMV dalam jaringan tanaman anyelir dapat dibebaskan melalui penggunaan senyawa antiviral yang dikombinasikan dengan kultur meristem ujung, dan senyawa antiviral amantadin lebih efektif dibandingkan 2-thiouracil.