Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi Agens Hayati Bakteri Penghasil Ahl-Laktonase Dan Ekspresinya Pada Escherichia Coli

Abstract

AHL-laktonase merupakan enzim pendegradasi N-acyl homoserine lactone (AHL) dalam quorum sensing (QS). Degradasi AHL dapat mengacaukan komunikasi antar sel bakteri patogen tumbuhan. Mekanisme ini disebut sebagai quorum quenching (QQ). Mekanisme QQ dapat mencegah ekspresi faktor virulensi bakteri patogen yang diekspresikan seperti enzim, toksin, dan eksopolisakarida. AHL-laktonase dihasilkan oleh bakteri tertentu, namun di Indonesia informasi tentang bakteri ini dan potensinya sebagai agens hayati belum banyak dilaporkan. Sehingga penelitian ini bertujuan untuk menapis, mengidentifikasi, mengkloning dan mengekspresikan gen aiiA penyandi AHL-laktonase pada Escherichia coli BL21 (DE3), serta menguji potensi agens hayati bakteri penghasil AHL-laktonase sebagai anti-QS terhadap Chromobacterium violaceum dan Dickeya dadantii. Penapisan bakteri penghasil AHL-laktonase dilakukan dengan uji anti-QS, antibiosis, dan deteksi gen aiiA dengan PCR menggunakan primer spesifik. Identifikasi bakteri dilakukan dengan perunutan DNA gen 16S rRNA. Gen aiiA dikloning pada plasmid pTZ57R/T dengan metode TA-kloning dan dirunut sekuen nukleotidanya. Sekuen yang diperoleh dianalisis tingkat homologinya terhadap gen aiiA yang ada di GenBank. Gen aiiA disubkloning ke dalam vektor ekspresi pET-28a pada situs enzim restriksi BamHI dan SalI, kemudian diekspresikan pada E. coli BL21 (DE3). Protein hasil ekspresi dianalisis dengan sodium dedocyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Bobot protein diperkirakan dengan perangkat lunak ExPaSy. Uji potensi agens hayati bakteri penghasil AHL-laktonase dan E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA dilakukan terhadap bakteri penyebab penyakit busuk lunak D. dadantii. Hasil penapisan diperoleh 21 dari 31 isolat bersifat anti-QS terhadap C. violaceum, namun dua isolat bersifat antibiosis yakni isolat B13 dan EKK10. Isolat yang bersifat anti-QS dan tidak bersifat antibiosis selanjutnya dideteksi dengan primer spesifik gen aiiA penyandi AHL-laktonase. Hasil deteksi gen aiiA diperoleh 4 dari 19 isolat tersebut memiliki gen aiiA. Keempat isolat bakteri tersebut yaitu B37, GG3, GG6, dan BT2. Keempat isolat tersebut mampu menekan virulensi D. dadantii dengan ditandai adanya penghambatan busuk lunak pada anggrek dan kentang secara signifikan. Penghambatan tertinggi ditunjukkan oleh isolat GG6 pada anggrek dengan tingkat hambatan relatif sebesar 55.2% dan isolat BT2 pada kentang dengan tingkat hambatan relatif sebesar 36.7%. Hasil perunutan DNA keempat isolat menunjukkan gen aiiA berukuran 753 pb. Analisis sekuen nukleotida gen aiiA dan asam amino AiiA menunjukkan bahwa isolat B37 (aiiAB37/AiiAB37), GG3 (aiiAGG3/AiiAGG3), GG6 (aiiAGG6/AiiAGG6), dan BT2 (aiiABT2/AiiABT2) memiliki homologi yang tinggi dengan sekuen gen aiiA dan AiiA yang telah terdeposit pada GenBank, serta memiliki bagian asam amino terkonservasi yaitu 103SHLHFDH109 dan 166TPGHSPGH173 yang merupakan ciri kelompok enzim metallo-beta-lactamase. Struktur protein asam amino AiiA keempat isolat mempunyai kemiripan dengan struktur protein tersier AHL-hidrolase. Bobot molekul protein keempat AiiA berkisar 28.096-28.25 kDa. Analisis protein dengan SDS-PAGE menunjukkan gen aiiA yang diekspresikan berukuran sekitar 32 kDa, yang terdiri dari fusi protein berukuran 3.8 kDa dari plasmid pET-28a dan 28 kDa dari AiiA, namun ekspresi proteinnya perlu dioptimasi lebih lanjut. Gen aiiA yang diekspresikan pada E. coli BL21 (DE3) dengan IPTG 0.75 mM dan suhu inkubasi 37 oC terekspresi pada fraksi insoluble (pelet sel) dan tidak terekspresi pada supernatan. E. coli BL21 (DE3) rekombinan aiiA mampu menghambat QS yang lebih tinggi terhadap C. violaceum dengan diameter hambat mencapai 34 mm dan mampu menekan virulensi D. dadantii pada kentang dengan tingkat hambatan relatif yang lebih tinggi yakni mencapai 63.3%. Hasil identifikasi berdasarkan sekuen gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat B37 mempunyai homologi tertinggi dengan Brevibacillus brevis strain NBRC15304, isolat GG3 dan GG6 mempunyai homologi tertinggi dengan Bacillus cereus ATCC14579, dan isolat BT2 mempunyai homologi tertinggi dengan B. thuringiensis ATCC10792. B. brevis belum pernah dilaporkan sebelumnya sebagai bakteri penghasil AHL-laktonase. Sekuen nukleotida dari 16S rRNA dan gen aiiA yang diperoleh dari penelitian ini telah didepositkan pada DDJB/EMBL/GenBank database dengan nomor aksesi: LC055677, LC055679, LC055680, LC055678, LC055758, LC05576, LC055761, dan LC055759. Kemampuan bakteri penghasil AHL-laktonase dalam menekan virulensi D. dadantii ini dapat menjadi infomasi tentang pemanfaatannya sebagai agens hayati. Informasi tersebut menambah pengetahuan terkait mekanisme pengendalian hayati selain antibiosis dan kompetisi. Hasil identifikasi bakteri-bakteri tersebut dapat menambah informasi tentang keragaman isolat-isolat bakteri penghasil AHL-laktonase. Selain itu, gen aiiA penyandi AHL-laktonase dapat digunakan sebagai material genetik untuk produksi AHL-laktonase atau perakitan tanaman yang tahan terhadap infeksi bakteri patogen tumbuhan.