Isolasi Bakteri Penghasil Lipase Termofilik Kloning Dan Ekspresi Gen Penyandi Lipase.

Abstract

Bakteri termofil merupakan kelompok bakteri yang dapat tumbuh optimal pada suhu 70-80oC. Enzim lipase yang berasal dari bakteri ini memiliki ketahanan terhadap denaturan kimia seperti detergen, agen chaotropic (urea, guanidinium chloride), pelarut organik dan pH ekstrem, sehingga cukup menjanjikan hasil yang maksimal untuk digunakan dalam proses industri. Lipase (triacyl glycerol acylhidrolase EC 3.1.1.3) merupakan kelompok enzim kelas hidrolase yang mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan ester pada rantai panjang asam lemak (trigliserida) menjadi gliserol dan asam lemak bebas pada permukaan air dengan minyak. Selain itu lipase mendapat perhatian khusus karena keunikannya yaitu pada kondisi yang sedikit air (micro-aqueous) mampu mengkatalisis reaksi esterifikasi, trans-esterifikasi, aminolisis dan asidolisis. Tujuan penelitian ini ialah melakukan isolasi bakteri termofilik penghasil lipase; identifikasi dari isolat terpilih; kloning dan ekspresi gen lipase dari isolat terpilih yang berasal dari sumber air panas geiser di Cisolok, Sukabumi, Jawa Barat yang suhunya dapat mencapai 95oC. Bakteri termofil yang diisolasi dari sumber air panas geiser, Sukabumi, Jawa Barat, Indonesia yang memiliki pH 8 dan suhu mencapai 95oC menggunakan metode pengenceran bertingkat yang disebar pada media padat Luria Bertani Rhodamine B. Bakteri termofil ini memiliki kemampuan menghasilkan lipase secara ekstraseluler yang ditunjukkan dengan terjadinya pendaran orange bila diamati di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 350 nm. Isolat yang diperoleh diukur kemampuannya dalam menghasilkan lipase dengan metode titrasi. Isolat bakteri termofilik S4-01 memiliki aktivitas tertinggi sebesar 3.91 U menit-1 yang dipilih untuk dilakukan uji selanjutnya. Identifikasi bakteri dilakukan secara molekuler dengan metode 16S rRNA, hasil sekuensing parsial gen 16S rRNA menunjukkan isolat ini berkerabat paling dekat dengan Bacillus amyloliquefaciens. Gen lipase yang berasal dari isolat S4-01 diisolasi dengan primer BamyKpnI-F dan BamyNotI-R yang didesain berdasarkan gen yang diambil dari genebank ncbi.nih.nlm.gov. Hasil isolasi menunjukkan gen lipase memiliki panjang 645 pb dan telah berhasil dikloning ke dalam vektor p-GEMT-Easy pada E. coli TOP10 dengan metode heat shock. Untuk ekspresi gen lipase dilakukan pada vektor ekspresi pET15-by dalam inang E. coli BL21(DE3) pLyss. Produksi lipase rekombinan dilakukan dengan induksi 0.5 mM IPTG pada nilai 0.5-0.6 OD600nm. Penentuan suhu optimum dilakukan dengan metode 4-para nitrofenil palmitat (pNPP) dan pH optimum menggunakan metode 4-para nitrofenil oktanoat (pNPC). Hasil uji menunjukkan lipase rekombinan ini memiliki suhu dan pH optimum pada 40oC dan pH 8. Pengujian terhadap pelarut organik dengan metode pNPP menunjukkan bahwa lipase rekombinan toleran terhadap n-heksan dan substrat nitrofenil ester dilakukan dengan metode pNPP dan pNPC yang menunjukkan lipase rekombinan lebih suka terhadap substrat C6 (heksanoat) dan C14 (miristat).