Konstruksi Dan Analisis Pustaka Metagenomik Yang Mengekspresikan Senyawa Bioaktif Untuk Mengendalikan Xanthomonas Oryzae Pv. Oryzae Pada Tanaman Padi

Abstract

Xanthomonas oryzae pv. oryzae penyebab penyakit hawar daun bakteri merupakan bakteri patogen penting pada pertanaman padi di dunia, termasuk Indonesia. Berbagai upaya telah dilakukan dalam pengembangan teknologi pengendalian patogen tersebut seperti eksplorasi agens hayati atau senyawa bioaktifnya untuk menekan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae, namun metode yang digunakan terbatas untuk agens hayati dan senyawa bioaktif dari mikrob yang dapat dikulturkan pada media buatan. Disisi lain, biosfer didominasi oleh berbagai jenis mikrob yang tidak dapatdikulturkan pada media buatan. Teknologi baru yang disebut metagenomika dikembangkan untuk mengatasi keterbatasan dari metode konvensional. Tujuan penelitian ini adalah mengonstruksi pustaka metagenomik dari mikrob pada rizosfer tanaman padi, melakukan analisis fungsional dari klon pustaka metagenomik terhadap X. oryzae pv. oryzae untuk menghasilkan klon yang mempunyai aktivitas antibiosis terhadap X. oryzae pv. oryzae, memperoleh informasi tentang DNA sisipan yang mengodekan senyawa bioaktif anti-X. oryzae pv. oryzae, dan menganalisis potensi senyawa bioaktif dari pustaka metagenomik dalam menekan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae. Pengambilan sampel rizosfer padi dilakukan dengan metode random purposive sampling dari beberapa daerah, yaitu Sleman, Daerah Istimewa Yogyakarta; Subang, Jawa Barat; Barito Kuala, Kalimantan Selatan; dan Indragiri Hilir, Riau. Konstruksi pustaka metagenomik dilakukan melalui tahapan ekstraksi DNA total secara langsung dari rizosfer tanaman padi yang dilanjutkan dengan fragmentasi, ligasi DNA sisipan dengan vektor pUC19, transformasi plasmid rekombinan mengandung DNA sisipan ke dalam sel inang kompeten (E. coli DH5α), dan seleksi transforman dengan seleksi biru putih. Klon pustaka metagenomik berupa koloni bakteri berwarna putih dipilih untuk analisis lebih lanjut. Analisis fungsional klon pustaka metagenomik terhadap X. oryzae pv. oryzae dilakukan dengan metode paper disc diffusion assays untuk melihat aktivitas antibiosis dalam penekanan X. oryzae pv. oryzae secara in-vitro. Konfirmasi keberadaan DNA sisipan pada klon pustaka metagenomik potensial dilakukan dengan teknik PCR koloni menggunakan pasangan primer M13F (-20) (5´- GTA AAA CGA CGG CCA GT-3´) dan primer M13R (-24) (5´-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3´). Analisis fragmen DNA sisipan dari klon pustaka metagenomik potensial dilakukan untuk mengetahui tingkat homologi dari fragmen DNA sisipan tersebut dengan gen lain yang tersedia pada GenBank database. Analisis lebih lanjut dilakukan untuk melihat potensi senyawa bioaktif dari klon pustaka metagenomik dalam menekan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae melalui dua macam percobaan. Percobaan pertama dilakukan dengan menguji senyawa bioaktif yang terdapat pada substrat cair dari klon pustaka metagenomik menggunakan teknik peracunan media. Percobaan kedua dilakukan dengan bioassay ekstrak kasar senyawa bioaktif dari klon pustaka metagenomik menggunakan metode paper disc diffusion. Ekstrak kasar senyawa bioaktif diperoleh dari hasil ekstraksi menggunakan pelarut n-heksan, kloroform, dan etil asetat. Berdasarkan analisis fungsional dari ratusan klon pustaka metagenomik, diperoleh tujuh klon (2, 10, 52, 63, 72, 77, dan 185) memproduksi senyawa bioaktif anti-X. oryzae pv. oryzae. Konfirmasi lebih lanjut dengan teknik PCR menggunakan pasangan primer M13/pUC menunjukkan empat klon pustaka metagenomik, yaitu klon 52, 72, 77, dan 185 masing-masing mengandung DNA sisipan berukuran ±600 bp, ±1 500 bp, ±600 bp, dan lebih dari >10 kb. Hal ini menunjukkan bahwa seluruh atau sebagian dari DNA sisipan yang terdapat di dalamnya merupakan gen fungsional yang terlibat dalam pengendalian X. oryzae pv. oryzae. Analisis urutan nukleotida difokuskan pada dua fragmen DNA sisipan dengan panjang ±600 bp yang terdapat pada klon 52 dan ±1 500 bp pada klon 72. Kedua amplikon ini dipilih karena menunjukkan hasil yang konsisten dalam mempertahankan keberadaan DNA sisipan di dalam selnya. Hasil analisis homologi menunjukkan bahwa urutan nukleotida dari fragmen DNA sisipan pada klon pustaka metagenomik 52 dan 72 tidak memiliki kesamaan dengan urutan DNA gen lain pada GenBank database. Hasil penjajaran hypothetical protein dari kedua klon pada analisis lanjutan menunjukkan bahwa amplikon dari klon pustaka metagenomik 52 (±600 bp) memiliki tingkat kesamaan 62%-64% dengan histidinol dehidrogenase dan amplikon kedua dari klon pustaka metagenomik 72 (±1 500 bp) memiliki tingkat kesamaan 57% dengan enzim 3'-5' eksonuklease. Hal ini menunjukkan kebaruan dari gen pengkode senyawa bioaktif anti-X. oryzae pv. oryzae yang diperoleh dengan teknik metagenomik. Pembacaan nilai OD600 dilakukan untuk melihat pengaruh senyawa bioaktif anti patogen pada substrat cair dari pustaka metagenomik 52, 72, dan 185 terhadap pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae. Hasil analisis menunjukkan bahwa setiap perlakuan yang diuji memiliki pengaruh yang signifikan terhadap pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae. Pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae paling rendah diamati pada perlakuan senyawa bioaktif dari klon 72 dengan hasil yang konsisten dari awal hingga akhir pengamatan. Ekstraksi dilakukan pada senyawa bioaktif dari klon 52 dan 72. Kedua klon pustaka metagenomik tersebut dipilih karena menunjukkan hasil yang paling konsisten berdasarkan uji aktivitas antibiosis dan konfirmasi keberadaan DNA sisipan. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa senyawa bioaktif dari klon 52 dapat diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat, senyawa bioaktif dari klon 72 dapat diekstraksi menggunakan pelarut n-heksan dan etil asetat dengan tingkat penekanan yang berbeda. Senyawa bioaktif dari klon 72 yang diekstraksi menggunakan pelarut n-heksan menunjukkan penekanan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae paling baik. Dengan demikian konstruksi pustaka metagenomik yang mengekspresikan senyawa bioaktif anti-X. oryzae pv. oryzae telah berhasil dilakukan dan diperoleh 2 klon potensial, yaitu klon 52 dan 72 berdasarkan berbagai tahapan analisis yang dilakukan.