Pengembangan Immunostrip dengan Menggunakan Partikel Nano Emas untuk Melacak Aflatoksin M1 dalam Contoh Susu

Abstract

Aflatoksin M1 (AFM1) merupakan metabolit hasil hidroksilasi aflatoksin B1 (AFB1). Ketika hewan ruminansia diberi pakan yang mengandung AFB1, maka AFB1 akan termetabolisme menjadi AFM1. AFM1 bersifat toksik akut dan kronis untuk hewan dan manusia. Metabolit aflatoksin tersebut menyebabkan penyakit berbahaya, diantaranya kerusakan hati akut, sirosis hati, memicu pertumbuhan tumor dan juga teratogen. Meskipun toksisitas AFM1 lebih rendah dibandingkan senyawa induknya AFB1, tetapi senyawa ini juga bersifat karsinogenik sehingga pada tahun 2002 telah diklasifikasikan sebagai karsinogen grup 1 oleh International Agency for Research on Cancer (IARC). AFM1 ini dapat termakan oleh manusia, terutama bayi dan anak-anak melalui susu segar, susu pasteurisasi, susu UHT, susu formula, dan air susu ibu (ASI). Mengingat bahaya AFM1 terhadap kesehatan, maka melacak keberadaan AFM1 dalam susu dan hasil olahannya sangat diperlukan untuk mencegah dampaknya pada masyarakat. Teknik melacak yang digunakan berperan penting dalam menentukan aman tidaknya susu dan hasil olahannya untuk dimakan. Penelitian ini dilakukan untuk mengembangkan teknik penapisan awal dengan memurnikan antibodi, sintesis antigen AFM1-BSA, konjugasi antibodi AFM1-partikel nano emas, serta uji mutu immunostrip yang dikembangkan untuk melacak AFM1 pada contoh susu. Kegiatan penelitian yang dilakukan meliputi pemurnian antibodi dari serum kelinci, sintesis antigen AFM1-BSA, pembuatan konjugat anti AFM1 dengan partikel nano emas, pengembangan dan uji mutu immunostrip. Antibodi yang digunakan merupakan antibodi poliklonal milik Balai Besar Penelitian Veteriner (BB LITVET) yang diperoleh dari serum kelinci yang diimunisasi dengan AFM1-BSA. Antibodi terhadap AFM1 diuji dengan teknik DBIA. Antibodi poliklonal dimurnikan melalui pengendapan menggunakan ammonium sulfat jenuh, kemudian dialisis dan difraksinasi menggunakan kolom HiTrap protein A HP. Kadar antibodi dihitung menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm dan antibodi G (Ig G) dikarakterisasi menggunakan teknik SDS-PAGE. Selanjutnya, Ig G dikonjugasikan dengan partikel nano emas (AuNP). Antigen AFM1-BSA disintesis dengan cara mereaksikan AFM1 baku dan BSA melalui reaksi dengan CMO sebagai reaksi penghubung. Seluruh pereaksi yang terdiri dari antigen AFM1-BSA, konjugat anti AFM1-AuNP dan Ig G kambing anti-Ig G kelinci diterapkan pada bahan strip dan ditentukan kondisi optimumnya. Pengujian mutu immunostrip dan pelacakan AFM1 dilakukan menggunakan immunostrip yang dikembangkan dan dibandingkan dengan immunostrip komersial (Agrastrip®). Contoh susu yang digunakan pada percobaan ini sebanyak 19 contoh terdiri dari 15 contoh susu murni, lima contoh susu komersial impor dan empat contoh susu yang ditambahkan dengan 0 – 1 ng/ml AFM1 baku. Hasil uji DBIA menunjukkan adanya reaksi khas antara antigen AFM1-BSA dengan antibodi terhadap AFM1-BSA dalam serum kelinci yang terlihat dengan terbentuknya noktah berwarna coklat setelah penambahan substrat DAB. Hasil fraksinasi menunjukkan bahwa antibodi tersebut merupakan antibodi G (Ig G) dengan rantai berat dan memiliki berat molekul 150 kDa dan 168,993 kDa. Ig G yang dikonjugasikan dengan AuNP adalah fraksi ke-3 dengan kadar 1,952 mg/ml. Kondisi optimum untuk konjugasi antibodi AFM1 dengan AuNP terjadi pada pH 8,5 dan penambahan 135 μl Ig G ke dalam 100 μl AuNP (0,01M), warna yang dihasilkan sama dengan atau mendekati warna larutan AuNP sebelum direaksikan. Kandungan antibodi dan AuNP pada kondisi optimum tersebut selanjutnya digunakan sebagai dasar untuk reaksi konjugasi dengan volume yang lebih banyak, sehingga dihasilkan endapan berwarna merah keunguan setelah larutan konjugat disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 g selama 10 menit pada suhu empat derajat Celcius. Antigen sebanyak 3,66 mg/ml diperoleh dari hasil sintesis AFM1-BSA. Berdasarkan hasil uji mutu, diketahui bahwa immunostrip yang dikembangkan dapat melacak AFM1 dengan batas terendah sebesar 0,25 ng/ml. Hasil pengujian 19 contoh susu dengan immunostrip tersebut memiliki tingkat kepekaan lebih rendah, namun memiliki tingkat kekhususan lebih tinggi dan waktu yang lebih cepat dibandingkan dengan Agrastrip®.