Kloning Dan Ekspresi Gen Penyandi Asil Homoserin Lakton Laktonase Dari Bacillus Cereus Int1c Dan Bacillus Thuringiensis Sgt3g

Abstract

Quorum sensing (QS) merupakan mekanisme komunikasi di antara sel bakteri yang diperantarai oleh molekul sinyal asil homoserin lakton (AHL) dan mekanismenya bergantung pada kepadatan jumlah sel. Pada umumnya bakteri fitopatogen menggunakan mekanisme QS untuk mengekspresikan gen virulensi pada saat menginfeksi tanaman. Penghambatan ekspresi gen virulen tersebut dapat dilakukan dengan mendegradasi senyawa AHL menggunakan AHL-laktonase. AHL-laktonase merupakan kelompok enzim yang berfungsi untuk menghidrolisis cincin lakton pada molekul AHL. Enzim ini umumnya ditemukan pada kelompok Bacillus dan disandikan oleh gen aiiA. Isolasi bakteri dari sampel tanah dan daun asal lahan pertanian di Jawa telah berhasil mendapatkan dua isolat yang mampu menghasilkan AHL-laktonase dengan aktivitas yang tinggi. Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning gene AHL-laktonase dari isolat Bacillus cereus INT1c and Bacillus thuringiensis SGT3g. Amplifikasi gen AHL-laktonase dari kedua isolat dengan menggunakan primer aiiA telah berhasil mendapatkan fragmen amplikon DNA berukuran 800 bp. Kedua isolat mempunyai gen aiiA dengan sekuen lengkap pada orf 2 yang menyandikan 250 asam amino. Analisis sekuen asam amino menggunakan BLAST-X menunjukkan bahwa asam amino dari B.cereus INT1c mempunyai homologi sebesar 98% dibandingkan dengan B.cereus (nomor akses WP.000216573.1), sedangkan B.thuringiensis SGT3g mempunyai homologi sebesar 99% dibandingkan dengan B.thuringiensis serovar aizawai (nomor akses AEY70474.1). Gen aiiA dari kedua isolat diekspresikan di dalam sel E.coli BL21(DE3). Pemotongan plasmid rekombinan dengan menggunakan BamHI dan NdeI menunjukkan adanya fragmen DNA berukuran 5708 bp (pET15b) dan 800 bp (DNA sisipan) pada gel agarosa 1.5%. Hasil ini membuktikan bahwa plasmid rekombinan telah diperbanyak di dalam sel transforman. Induksi ekspresi gen dilakukan ketika fase eksponensial menggunakan IPTG. Penambahan 1 mM IPTG ketika OD600 kultur mencapai 0.6 dapat menghasilkan protein AiiA dengan aktivitas tinggi. Sementara itu rekombinan E.coli dengan OD600 0.8 tidak menunjukkan adanya aktivitas degradasi. Hasil ini mengindikasikan bahwa protein AiiA dari E.coli rekombinan dapat mendegradasi senyawa AHL dari Chromobacterium violaceum sehingga jumlah AHL tidak mencapai quorum untuk menginduksi ekspresi gen yang bertanggung jawab untuk produksi violacein. Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa protein AiiA dari kedua isolat mempuyai berat 28.77 kDa.