Isolasi Dan Karakterisasi Protein Kepiting (Scylla Serrata), Cumi-Cumi (Photololigo Duvaucelii), Kacang Hijau (Vigna Radiata (L.) R. Wilczek), Dan Kacang Koro Pedang (Canavalia Ensiformis (L.) Dc) Untuk Pembuatan Isolat Alergen

Abstract

Alergi makanan merupakan salah satu reaksi hipersensitivitas yang memiliki manifestasi klinik yang cukup fatal. Sampai saat ini, metode pencegahan penyakit alergi pangan yang dianjurkan adalah menghindari pangan sumber alergen, yaitu protein penyebab alergi. Hal ini menyebabkan alergi merupakan masalah ganda yaitu reaksi imun yang tidak normal dan berdampak pada kondisi kekurangan zat gizi protein. Untuk menghindari hal tersebut, diagnosis alergi pangan sangat penting dilakukan. Diagnosis alergi pangan bertujuan untuk mengetahui penyebab alergi pangan sehingga hanya menghindari atau membatasi mengkonsumsi makanan penyebab alergi. Skin prick test (SPT) atau uji tusuk kulit merupakan metode yang dipercaya dan diyakini dapat digunakan untuk mengetahui penyebab alergi yang dimediasi oleh antibodi IgE. Bahan utama yang digunakan untuk SPT adalah ekstrak alergen atau reagen SPT yang ketersediaannya di rumah sakit atau klinik di Indonesia masih kurang dan masih impor. Penelitian ini bertujuan untuk membuat reagen SPT dari bahan baku lokal terdiri dari makanan laut (cumi-cumi dan kepiting) dan kacang-kacangan (kacang hijau dan kacang koro pedang). Spesifikasi reagen SPT mengacu pada standar European Pharmacopoeia 7 Monograph on Allergen Products 01/2010:1063 (EDQM 2010). Metode ekstraksi protein yang digunakan pada pangan laut adalah dengan cara memisahkan protein sarkoplasma dan miofibril sedangkan isolasi protein kacang dilakukan dengan metode isoelektrik. Karakterisasi isolat dilakukan dengan metode elektroforesis dan uji alergenisitas dilakukan dengan metode ELISA dan immunoblotting. Pembuatan reagen SPT dilakukan secara aseptis menggunakan larutan gliserol saline. Setelah memenuhi persyaratan European Pharmacopoeia Monograph on Allergen Products 7 01/2010:1063 (EDQM 2010), reagen SPT diaplikasikan pada uji SPT menggunakan responden manusia kemudian dihitung sensitivitas dan spesifisitas diagnosisnya. Rendemen protein miofibril dan sarkoplasma cumi-cumi hasil ekstraksi masing-masing adalah 27,8% dan 19,4% (% protein cumi-cumi). Fraksi protein miofibril terdiri dari 11 pita protein dengan bobot molekul 18,2 -108,4 kDa dan fraksi protein sarkoplasma terdiri dari 13 pita protein dengan bobot molekul 9,5-119,3 kDa. Protein miofibril yang bersifat alergen adalah bobot molekul 8,9 – 122,7 kDa dan protein sarkoplasma yang bersifat alergen adalah 11,8 -143,9 kDa. Reagen miofibril dan sarkoplasma cumi-cumi memenuhi persyaratan European Pharmacopoeia 7 Monograph on Allergen Products 01/2010:1063 untuk parameter kadar air, kadar protein, sterilitas dan mikrobiologi. Uji tusuk kulit pada responden menunjukkan bahwa nilai sensitivitas reagen miofibril cumi-cumi adalah 86% dan sarkoplasma cumi-cumi adalah 64% dengan tingkat kesalahan negatifnya untuk masing-masing reagen miofibril dan sarkoplasma adalah 14% dan 36%. Hasil diagnosis miofibril dan sarkoplasma cumi-cumi akan diperoleh nilai sensitivitas 100%. Pemisahan protein cumi-cumi menjadi mofibril dan sarkoplasma untuk uji tusuk kulit dapat meningkatkan nilai sensitivitasnya dan menurunkan kesalahan diagnosis negatif. Nilai spesifisitas masing-masing protein miofibril dan sarkoplasma adalah 100% dengan tingkat kesalahan terjadinya diagnosis positif 0 %. Rendemen protein miofibril dan sarkoplasma kepiting masing-masing adalah 28,4% dan 18,4% (% protein kepiting). Fraksi protein miofibril terdiri dari 19 pita protein dengan bobot molekul 9.6-111.6 kDa dan fraksi protein sarkoplasma terdiri dari 19 pita protein dengan bobot molekul 9,5-104,6 kDa. Protein miofibril yang bersifat alergen adalah bobot molekul 13.9-155.4 kDa dan protein sarkoplasma yang bersifat alergen adalah 8.4-129.4 kDa. Reagen miofibril dan sarkoplasma kepiting memenuhi persyaratan European Pharmacopoeia 7 Monograph on Allergen Products 01/2010:1063 untuk parameter kadar air, kadar protein, sterilitas dan mikrobiologi. Hasil SPT pada responden menunjukkan nilai sensitivitas reagen miofibril kepiting adalah 85% dan sarkoplasma kepiting adalah 69% dengan tingkat kesalahan negatifnya untuk masing-masing reagen miofibril dan sarkoplasma adalah 15% dan 31%. Sensitivitas diagnosis alergi kepiting adalah 100%. Pemisahan protein kepiting menjadi mofibril dan sarkoplasma untuk uji tusuk kulit dapat memperbaiki nilai sensitivitasnya dan menurunkan kesalahan diagnosis negatif. Nilai spesifisitas masing-masing protein miofibril dan sarkoplasma adalah 100% dengan tingkat kesalahan terjadinya diagnosis positif 0 %. Kandungan protein isolat kacang hijau adalah 87,98% dengan rendemen 82,70% dan recovery 20.5 g/100g. Isolat protein kacang hijau terdiri dari 16 pita protein dengan berat molekul 11.1-127.4 kDa. Protein alergen kacang hijau mempunyai bobot molekul 10.9-142.2 kDa kDa setelah dianalisis dengan metode immunoblotting. Hasil analisis menunjukkan bahwa reagen kacang hijau untuk SPT memenuhi persyaratan European Pharmacopoeia untuk parameter kadar air, kadar protein, sterilitas dan mikrobiology. Hasil Skin Prick test terhadap responden menunjukkan bahwa sensitivitas reagen kacang hijau dalam diagnosis alergi adalah 75% dengan tingkat kesalahan negatif 25%. Spesifisitas reagen kacang koro pedang adalah 100% dengan tingkat kesalahan positif adalah 0%. Kandungan protein isolat kacang koro pedang adalah 85,90% dengan rendemen 64,30% dan recovery 21.0 g/100g. Isolat protein kacang koro pedang terdiri dari 15 pita protein dengan berat molekul 11,6-77,4 kDa. Protein alergen kacang koro pedang mempunyai bobot molekul 18,2-127,7 kDa setelah dianalisis dengan metode immunoblotting. Hasil analisis menunjukkan reagen kacang koro pedang untuk SPT memenuhi European Pharmacopoeia untuk parameter kadar air, kadar protein, sterilitas dan mikrobiologi. Hasil SPT terhadap responden menunjukkan bahwa sensitivitas reagen kacang koro pedang dalam diagnosis alergi adalah 87,5% dengan tingkat kesalahan negatif 12,5%. Spesifisitas reagen kacang koro pedang adalah 100% dengan tingkat kesalahan positif adalah 0%. Uji stabilitas reagen SPT miofibril cumi-cumi, sarkoplasma cumi-cumi, kacang hijau, dan kacang koro pedang stabil pada suhu anjuran penyimpanan 2-8°C untuk parameter kadar protein dan kemampuan mengikat IgE spesifik.