Disain Nested Primer Gen Hemolisin Untuk Mendeteksi Vibrio harveyi pada Udang Penaeid Melalui PCR

Abstract

Litopenaeus vannamei atau udang putih merupakan salah satu komoditas unggulan dalam budidaya perikanan di Indonesia. Spesies penaeid ini memiliki beberapa keunggulan dibanding spesies udang lainnya, antara lain produktivitasnya yang tinggi dapat mencapai lebih dari 13.600 kg/ha, masa panennya lebih cepat, serta lebih resisten terhadap penyakit. Meskipun lebih resisten, penyakit bakterial vibrio berpendar yang disebabkan oleh Vibrio harveyi masih menjadi kendala dalam usaha pembenihan udang putih di Indonesia. Aplikasi teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) memungkinkan untuk melakukan deteksi dini suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri, termasuk vibriosis pada udang. Nested PCR merupakan variasi dari reaksi PCR biasa. Pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR dimana hasil dari PCR pertama menjadi DNA cetakan bagi PCR kedua. Keuntungan dari nested PCR adalah meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer yang sekaligus juga dapat meningkatkan sensitivitas PCR. Gen hemolisin diketahui mempunyai spesifisitas dan sensitivitas yang lebih baik dibanding gen toxR dan gen gyrB sebagai penanda molekuler dalam mendeteksi V. harveyi. Penelitian ini bertujuan untuk mendisain primer nested PCR menggunakan gen hemolisin untuk mendeteksi Vibrio harveyi pada udang penaeid. Sekuen gen hemolisin dari sampel V. harveyi MR5339 dan V. harveyi 275 dideteksi menggunakan primer yang didisain dari sekuen gen lengkap hemolisin V. harveyi strain VIB 391 (nomor akses: DQ640264) mulai dari urutan ke-133 sampai urutan ke-756. Primer nested PCR didesain dari sekuen gen hemolisin isolat V. harveyi MR 5339 yang berhasil teramplifikasi oleh primer awal. PCR I nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-52 sampai urutan ke-405 dan PCR II nested PCR didesain untuk mengamplifikasi urutan ke-204 sampai urutan ke-405. Hasil uji spesifisitas menunjukkan bahwa primer nested PCR hasil disain hanya mampu mengamplifikasi isolat-isolat V. harveyi. Hasil PCR bagi isolat-isolat bakteri V. parahaemolyticus, V. campbelli, Salmonella sp., Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, dan Streptococcus iniae yang juga diujikan diketahui tidak terdapat hasil amplifikasi. Berdasarkan uji sensitivitas diketahui bahwa primer nested PCR hasil disain mampu menDisain Primer V. harveyi sampai kepadatan 100 cfu/ml atau konsentrasi DNA sampai 101 fg/μl. Melalui uji surveillance diketahui bahwa deteksi terendah adalah pada sampel hari ke-3 ekstrak DNA udang mati suspect V. harveyi MR 5339 infeksi awal sebanyak 101 cfu/ml.