Konstruksi pustaka cdna dan analisis ekspresi gen pada klon karet resisten terhadap penyakut gugur daun corynespora cassiicola

Abstract

Dari 9 klon karet dengan tingkat resistensi berbeda terhadap infeksi C. cassiicola telah diuji resistensinya secara terkontrol terhadap isolat C. cassiicola. Dari pengujian tersebut telah dipilih satu klon resisten, yakni AVROS 2037, untuk digunakan sebagai sumber RNA dalam konstruksi pustaka cDNA. Keberhasilan proses konstruksi cDNA tergantung pada kualitas total RNA. Oleh karena itu metode isolasi sering merupakan titik kritikal dalam hal ini. Dalam rangka mendapatkan RNA dengan kualitas tinggi dan tidak terdegradasi, telah diuji dua macam metode isolasi RNA. Metode SDS akhirnya ditetapkan sebagai metode yang sesuai untuk isolasi DNA dari daun tanaman karet. Aplikasi metode SDS dengan menggunakan daun tanaman dewasa klon AVROS 2037, telah berhasil diperoleh RNA dengan kualitas dan kuantitas tinggi. Sebanyak 0,25% mRNA dapat dimurnikan dari RNA total tersebut dan dengan kualitas baik. Selanjutnya dengan cara transkipsi balik terhadap m RNA menggunakan enzim reverve trancriptase, cDNA dengan kualitas tinggi berhasil diperoleh. Sedangkan fraksinasi fragmen cDNA menggunakan kolom CHROMA SPIN-400 telah berhasil memisahkan fragmen cDNA dengan ukuran 500bp ke atas. Fragmen tersebut akan diligasikan ke vektor kloning untuk selanjutnya ditransformasi ke E. coli. Keberhasilan mendapatkan cDNA utas ganda dari daun tanaman karet menunjukkan bahwa berbagai tahapan kritikal telah dapat diatas. Salah satu tahap kritikal adalah mempertahankan RNA dan mRNA terhadap proses degradasi. Kedua molekul tersebut diketahui merupakan campuran komplek yang dengan mudah terdegradasi yang merepresentasikan proses transkrip dari gen-gen yang sedang aktif pada jaringan atau sel tertentu. Kloning fragmen cDNA dilakukan menggunakan vektor pGEM® -T Easy yang dimodifikasi dengan penambahan utas ganda oligonukleotida sepanjang 38 bp. Oligonukleotida tersebut memiliki situs enzim restriksi Sfi I asimetrik sehingga apabila diligasikan ke vektor dan vektor kemudian dipotong dengan enzim Sfi I maka vektor tersebut sesuai untuk diligasikan dengan fragmen cDNA yang juga dipotong dengan enzim yang sama. Modifikasi vektor telah berhasil dilaksanakan dan transformasi vektor modifikasi ke bakteri E. coli DH5 kompeten menghasilkan koloni putih yang mengindikasikan bahwa oligo Sfi telah menyisip pada vektor. Vektor modifikasi selanjutnya disebut sebagai vektor pGEM® - T Easy – Oligo Sfi. Ligasi fragmen cDNA pada vektor pGEM® - T Easy – Oligo Sfi serta transformasinya pada bakteri E. coli DH5 kompeten telah menghasilkan sebanyak 6000 koloni dengan titer sebesar 2,7 x 10 cfu/µg, dimana 93% merupakan transforman. Ukuran fragmen cDNA yang diperoleh berkisar antara 300 – 2000 – bp. Studi ekspresi gen penyandi hevein pada klon karet resisten dan rentan, masing-masing diberi perlakuan patogen serta kontrolnya, tidak menunjukkan bahwa gen tersebut berperan dalam resistensi klon karet terhadap infeksi C.cassiicola.