Optimasi Produksi Penisilin Asilase (PAc) Menggunakan B. megaterium MS941 Rekombinan yang Mengandung Gen pac dari B. thuringiensis BGSC BD1 dengan Metode Respon Permukaan

Abstract

Penisilin asilase (PAc, EC 3.5.1.11) adalah enzim yang sangat berperan dalam reaksi hidrolisis benzilpenisilin untuk menghasilkan asam 6-amino penisilanat (6-APA) yang merupakan bahan dasar antibiotika penisilin semisintetis. Ukuran gen btpac-bd1 hasil amplifikasi PCR adalah 2397 bp. Respon surface methodology (RSM) atau metode permukaan respon dengan menggunakan dua variabel yang ditambahkan di media produksi, yaitu dengan xilosa sebagai induser dan CaCl2 sebagai kation divalent, telah digunakan untuk mendapatkan aktivitas dan aktivitas spesifik enzim PAc maksimal oleh B. megaterium btpacBD1. Untuk dapat mencapai tujuan ini, kombinasi lima tingkat konsentrasi xilosa (dengan rentang 0.13% s.d 0.87%) dengan lima tingkat konsentrasi CaCl2 (dengan rentang 0.64 mM s.d 4.36 mM) sebanyak 22 percobaan telah diujicobakan. Kultivasi batch dilakukan menggunakan labu erlenmeyer kocok pada suhu 28°C agitasi 180 rpm selama 48 jam kultivasi dengan volume kerja 100 mL dan 100 μL tetrasiklin sebagai media seleksi. Setiap percobaan diinokulasi dengan 10% inokulum dengan OD578nm sebesar 0.6 – 0.8 (Rajendhran et al. 2002). Pemisahan enzim dari media kultivasi dilakukan dengan sentrifugasi suhu 4°C 6000 rpm selama 15 menit. Aktivitas enzim PAc pada ekstrak enzim kasar diuji dengan metode Balasingham et al. (1972). Penentuan kadar protein menggunakan metode Bradford (1976) mengggunakan Bovine Serum Albumin sebagai standar. Aktivitas spesifik adalah jumlah unit enzim per milligram protein. Hasil komposisi media optimal diujicoba pada bioreaktor skala 10 Liter dengan volume kerja 5 Liter. Metode Central Composite Design (CCD) yang digunakan untuk menganalisa pengaruh antara kombinasi xilosa dan CaCl2 ketika B. megaterium btpacBD1 dikultivasi pada skala labu erlenmeyer menunjukkan bahwa xilosa dan CaCl2 memberikan pengaruh yang nyata terhadap aktivitas PAc dari B. megaterium btpacBD1 dan model kuadratik dipilih berdasarkan hasil percobaan dengan (R2=0.86 (nilai p < 0.0001)). Aktivitas spesifik PAc tertinggi tercapai dan saat konsentrasi xilosa dan CaCl2 0.49% dan 2.40 mM pada pH medium sekitar 7. Pada kondisi itu, aktivitas PAc yang didapatkan sebesar 1.318 ± 0.406 U/mL dengan kadar protein 0.0101 ± 0.01 mg/mL dan aktivitas spesifik 130.669 ± 50.241 U/mg. Verifikasi hasil komposisi media optimal pada labu Erlenmeyer dilakukan dan menghasilkan aktivitas enzim PAc 1.294 ± 0.171 U/mL dengan kadar protein 0.0102 ± 0.0003 mg/mL dan aktivitas spesifik 125.910 ± 13.309 U/mg. Komposisi media optimal digunakan pada skala bioreaktor 10 L. Aktivitas tertinggi (2.0687 ± 0.0820 U/mL) dan kadar protein tertinggi (0.0078 ± 0.0008 mg/mL) didapatkan pada jam ke-48 waktu kultivasi. Sedangkan aktivitas spesifik tertinggi (1260.521± 27.5711 U/mg). dihasilkan pada jam ke-18 waktu kultivasi.