Penapisan dan Karakterisasi Aktinomiset Penghasil Senyawa Antibakteri Escherichia coli ATCC 35218 Resisten Antibiotik Beta-Laktam

Abstract

Diare dan gastroenteritis yang disebabkan oleh mikrob patogen, salah satunya E. coli, merupakan salah satu penyebab kematian tertinggi di Indonesia. Pengobatan yang paling umum adalah dengan pemberian antibiotik,namun, yang menjadi masalah adalah meningkatnya resistensi patogen terhadap antibiotik, khususnya golongan beta-laktam. Masalah tersebut menjadikan penemuan antibiotik baru sangat penting dan aktinomiset merupakan sumber yang sangat menjanjikan sebagai penghasil penghasil senyawa aktif baru tersebut. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan aktinomiset asli Indonesia yang menghasilkan senyawa antibakteri E. coli ATCC 35218 resisten antibiotik betalaktam dan mengidentifikasi ciri-ciri morfologi dan molekuler isolat aktinomiset penghasil senyawa antibakteri E. coli ATCC 35218 resisten antibiotik betalaktam tersebut. Sembilan puluh enam isolat aktinomiset dari kultur stok koleksi Biotechnology Microbial Culture Collection (BioMCC), BPPT, diremajakan di dalam media ISP2 (International Streptomyces Project) dan diinkubasikan pada suhu 28 oC selama 14-21 hari. Pengelompokan aktinomiset ke dalam kelompok Streptomyces dan non-streptomyces dilakukan berdasarkan morfologi mikroskopis dari biakan di dalam media agar ISP2 umur 21 hari. Penapisan aktivitas antibakteri dilakukan menggunakan metode agar plug dan adanya aktivitas antibakteri ditandai dengan zona bening di sekitar isolat aktinomiset setelah inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 36±1oC. Isolat aktinomiset yang menunjukkan aktivitas antibakteri selanjutnya dilakukan karakterisasi pola aktivitas antibakteri berdasarkan umur isolatdi dalam media agar Karakterisasi pola aktivitas antibakteri dari kultur agar dilakukan dengan menumbuhkan isolat aktinomiset pada media agar ISP2 dalam cawan selama 15 hari pada suhu 28 oC. Setiap 3 hari, dari kultur agar diambil untuk dilakukan uji aktivitas antibakteri menggunakan metode agar plug. Karakterisasi pola aktivitas antibakteri isolat aktinomiset aktif dari kultur cair dilakukan dengan memfermentasikan isolat di dalam media cair ISP2 dan diinkubasikan pada suhu 28 oC, 220 rpm, selama 15 hari. Setiap 3 hari fermentasi dilakukan pengambilan sampel dan dilakukan penyarian senyawa aktif dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut etil asetat, dengan perbandingan 1:1 (v/v). Ekstrak etil asetat yang diperoleh dipekatkan dan selanjutnya digunakan untuk uji aktivitas antibakteri menggunakan metode Kirby- Bauer pada konsentrasi 1 mg/disc. Isolat aktinomiset aktif juga dilakukan karakterisasi pola pertumbuhannya di dalam empat jenis media agar dan media cair yang meliputi media ISP2, ISP4, MS (Micromonospora Starch), dan BM (Bennet’s Medium). Karakterisasi pola pertumbuhan di dalam media agar dilakukan dengan menumbuhkan isolat aktinomiset ke dalam 4 jenis media tersebut dan diinkubasi pada suhu 28 oC selama 21 hari. Pengamatan yang dilakukan meliputi warna koloni, pembentukan miselia, dan pertumbuhan spora. Karakterisasi pola pertumbuhan di dalam media cair dilakukan dengan menumbuhkan isolat aktinomiset selama 15 hari, 28 oC, 220 rpm. Setiap 3 hari sampel diambil dan dilakukan pengukuran volume padatan selnya (% PMV). Karakterisasi morfologi mikroskopis isolat aktif dilakukan dengan pengamatan langsung terhadap kultur di dalam media ISP2 agar umur 21 hari dengan mikroskop pada perbesaran 500-1000x. Karakterisasi molekuler isolat aktif dilakukan berdasarkan sekuen parsial 16S rRNA dan dibandingkan dengan sekuen 16S rRNA yang terdapat di GenBank dengan blastn. Tingkat kekerabatan di analisis menggunakan perangkat lunak MEGA 5. Ekstrak etil asetat isolat aktinomiset dengan aktivitas antibakteri paling tinggi dilakukan analisis menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dan pendugaan berat molekul senyawa aktif dilakukan menggunakan quadrupole time of flight mass sphectrometry (QTOF-MS). Pengelompokan isolat aktinomiset berdasarkan morfologi dan warna, dari 96 isolat aktinomiset, 8 isolat termasuk dalam kelompok Streptomyces dan 88 isolat non-streptomyces. Penapisan aktivitas antibakteri mendapatkan tiga isolat, yaitu BioMCC-at.HH-64, BioMCC-at.HH-78, dan BioMCC-at.HH-259 yang menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap E. coli ATCC 35218 dengan rata-rata diameter penghambatan masing-masing adalah 13,55, 13,88 and 14,71 mm. Hasil karakterisasi pola aktivitas antibakteri dari kultur padat menunjukkan sampai umur 15 hari ketiga isolat masih memperlihatkan aktivitas antibakteri dan aktivitas tertinggi dihasilkan oleh kultur umur 9 hari. Hasil karakterisasi pola aktivitas antibakteri dari ekstrak etil asetat menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat dari isolat BioMCC-at.HH-64 sampai hari ke-15 fermentasi tidak menunjukkan aktivitas antibakteri. Aktivitas antibakteri ditunjukkan oleh ekstrak etil asetat dari isolat BioMCC-at.HH-78 dan BioMCC-at.HH-259 setelah 12 hari fermentasi, dan peningkatan aktivitas antibakteri ditunjukkan oleh ekstrak etil asetat dari fermentasi isolat BioMCC-at.HH-259 selama 15 hari. Hasil karakterisasi pola pertumbuhan isolat aktinomiset aktif, baik dalam media agar maupun cair ketiga isolat menunjukkan pola pertumbuhan yang relatif berbeda untuk media yang berbeda. Pola pertumbuhan paling baik ditunjukkan ketika isolat aktinomiset ditumbuhkan di dalam media ISP4. Hasil pengamatan morfologi mikroskopis menunjukkan bahwa ketiga isolat memiliki spora tunggal berbentuk bola, yang tumbuh pada pangkal atau percabangan hifa dan termasuk dalam genus Micromonospora. Hasil blastn menunjukkan bahwa ketiga isolat memiliki tingkat homologi tertinggi dengan M.chersina sebesar 99%. Berdasarkan hasil analisis kemiripan, isolat BioMCC-at.HH-64 memiliki tingkat kemiripan 99,17 % dengan BioMCC-at.HH-259. Sedangkan, isolat BioMCC-at.HH-78 memiliki tingkat kemiripan 42,57 % dengan BioMCC-at.HH-64 dan 42,74 % dengan BioMCC-at.HH-259. Hasil pendugaan terhadap berat molekul senyawa aktif adalah sebesar 186,12 Da yang merujuk pada senyawa napthylethylenediamine. Aktivitas antibakteri senyawa tersebut terhadap E coli ATCC 35218 belum pernah dilaporkan. Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa aktinomiset asli Indonesia memiliki potensi sebagai penghasil senyawa aktif antibakteri yang mampu menghambat E.coli ATCC 35218 resisten antibiotik beta-laktam.