Identitas Berbasis Molekuler Galur-Galur Rhizopus Asal Tempe Segar dari Berbagai Daerah di Indonesia

Abstract

Rhizopus Ehrenb. (Zygomycetes, Zygomycota) merupakan cendawan yang bernilai ekonomi penting karena kontribusinya pada berbagai aspek kehidupan manusia, seperti sumber suplemen makanan, enzim, dan agens bioteknologi industri. Oleh sebab itu, identitas dari galur-galur Rhizopus menjadi penting. Dalam 30 tahun terakhir, taksonomi dan identifikasi Rhizopus berubah dari pendekatan morfologi dan fisiologi ke pendekatan molekuler. Dengan pendekatan morfologi, Rhizopus dibagi dalam tiga grup, yaitu grup R. microsporus, grup R. oryzae, dan grup R. stolonifer. Pada tahun 2007, berdasarkan kombinasi morfologi, fisiologi, kompatibilitas sistem kawin, dan data molekuler, Zheng et al. mengenal 10 spesies Rhizopus dengan 7 varietas, yaitu R. americanus, R. arrhizus var. arrhizus, var. delemar, dan var. tonkinensis, R. caespitosus, R. homothallicus; R. microsporus var. microsporus, var. azygosporus, var. chinensis, var. oligosporus, var. tuberosus dan var. rhizopodiformis, R. niveus, R. reflexus, R. schipperae, R. stolonifer, dan R. sexualis. Pada tahun 2010, Abe et al. menerima delapan spesies Rhizopus versi Zheng et al. (2007) dengan menempatkan R. niveus sebagai sinonim R. delemar, R. sexualis dan R. americanus sebagai sinonim R. stolonifer, dan mempertahankan R. oryzae dengan melibatkan sekuen gen internal transcribed spacer (ITS) rDNA, gen aktin, dan gen translation elongation factor 1α (EF-1α). Kemudian pada tahun 2013, Dolatabadi et al. menggunakan konsep Genealogy Concordance Phylogenetic Species Recognition (GCPSR) dari gen ITS, aktin, dan EF-1α, sifat fisiologi termasuk suhu pertumbuhan maksimum, morfologi spora, uji tipe kawin, profil yang dihasilkan MALDI-ToF, dan ekologi, untuk mengevaluasi takson infraspesifik Rhizopus microsporus. Mereka menegaskan bahwa R. microsporus tidak dapat dibagi ke takson infraspesifik. Perubahan terbaru dalam sistematika Rhizopus ini mempengaruhi status taksonomi Rhizopus, termasuk Rhizopus dari tempe segar Indonesia. Dahulu Rhizopus di Indonesia diidentifikasi terutama dengan pendekatan morfologi dan sidik jari DNA. Pada tahun 1970, Dwijoseputro dan Frederick mengidentifikasi 4 spesies Rhizopus, yaitu R. oligosporus, R. oryzae, R. arrhizus, dan R. stolonifer pada tempe dan ragi tempe yang berasal dari Jakarta, Surakarta, dan Malang. R. oligosporus banyak dinyatakan sebagai inokulan tempe dari berbagai daerah di Indonesia pada tahun 2000-an, meskipun Schipper dan Stalpers pada tahun 1984 menempatkan oligosporus sebagai varietas dari R. microsporus. Pada sistem terkini, cara ini yang belum dapat mengidentifikasi Rhizopus secara tepat. Re-identifikasi Rhizopus asal tempe ini diperlukan untuk menunjang upaya standardisasi mutu tempe yang memerlukan inokulan dengan identitas yang tepat. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi informasi terkini, tentang taksonomi Rhizopus pada tempe segar di Indonesia. Sebanyak 36 galur Rhizopus spp. asal tempe segar yang berasal dari 26 lokasi di Indonesia diidentifikasi berdasarkan kombinasi dari ciri morfologi, fisiologi, dan analisis molekuler filogenetik berdasarkan sekuen gen ITS pada DNA ribosom dan gen EF-1α. Kultur murni diperoleh dengan cara mengambil hifa secara aseptik dan menginokulasinya pada medium potato dextrose agar (PDA), lalu diinkubasi pada suhu ruang. Kultur dimurnikan dan diperbanyak untuk kultur kerja, dan kultur stok. Kultur stok disimpan dalam medium trehalosa-gliserol pada suhu -80 oC. Galur Rhizopus hasil koleksi ini disimpan di Institut Pertanian Bogor Culture Collection (IPBCC), Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Analisis molekuler dimulai dengan ekstraksi DNA dari massa miselium yang ditumbuhkan pada medium miring PDA selama 3 hari. Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan DNA PhytopureTM Kit Extraction (GE Healthcare, Inggris) sesuai dengan protokol pabrik. Amplifikasi Polymerase Chain Reaction daerah rDNA ITS menggunakan sepasang primer ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3') dan ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3'). Amplifikasi gen EF-1α menggunakan sepasang primer MEF-10 (5'-GTTGTCATCGGTCACGTCGATTC-3') dan MEF-4 (5'-ATGACACCRACAG CGACGGTTTG-3'). Sekuen yang diperoleh dari primer ITS rDNA untuk semua galur dan EF-1α dari anggota R. microsporus diedit dengan program Chromas Pro 1.41. Semua sekuen ITS yang diperoleh, kemudian disejajarkan dengan sekuen rujukan yang diunduh dari pangkalan data DNA menggunakan program molecular evolution and genetic analysis (MEGA) versi 5.05. Pada analisis ini, kekerabatan dianalisis dengan metode Maximum Likelihood yang melibatkan semua galur koleksi, dan Neighbor Joining untuk galur koleksi R. microsporus. Dukungan untuk cabang internal diperoleh dengan analisis bootstrap (BS) 1000 ulangan. Nilai BS sebesar 50% atau lebih akan ditampilkan. Pohon filogenetik yang dihasilkan dari analisis tersebut, diolah dengan perangkat lunak TreeGraph versi 2. Morfologi galur Rhizopus diamati sesuai dengan standar monograf Rhizopus yang ditulis oleh Zheng et al. pada tahun 2007 dengan menggunakan mikroskop cahaya (Olympus BX53). Karakter fisiologi Rhizopus yang diamati ialah pertumbuhan Rhizopus pada suhu 33, 42, 46, 48 dan 51oC. Dua spesies Rhizopus, yaitu R. delemar dan R. microsporus ditemukan berasosiasi dengan sampel tempe segar dari 26 lokasi di Indonesia. R. delemar hanya ditemukan dari sampel tempe yang berasal dari satu lokasi (Palu, Sulawesi Tengah), sedangkan R. microsporus ditemukan dari tempe yang berasal dari berbagai lokasi di Sumatera, Jawa, Bali, Lombok, Nusa Tenggara Timur, Kalimantan, Sulawesi (selain di Palu), dan Papua Barat. Tidak ditemukannya R. delemar pada tempe yang berasal dari pulau Jawa, mengindikasikan adanya sumber daya genetik yang hilang. Hilangnya species ini diduga berkaitan dengan penggunaan inokulan komersial yang berbasis R. microsporus. Spesies lain seperti R. stolonifer dan R. oryzae yang sebelumnya pernah dilaporkan berasosiasi dengan tempe di Indonesia, juga tidak ditemukan pada penelitian ini, sedangkan R. oligosporus yang dulu pernah dilaporkan sekarang merupakan sinonim dari R. microsporus.