Mempelajari aktivitas keratinase dan disulfida reduktase dari Bacillus sp. MTS dalam degradasi keratin

Abstract

Keratin adalah suatu protein tidak larut dan sangat stabil karena tingginya ikatan disulfida. Ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik di dalam molekul yang memberikan kekuatan mekanik dan resistensi terhadap berbagai protease. Tujuan utama penelitian ini adalah mempelajari degradasi keratin bulu ayam oleh enzim enzim keratinolitik yang dihasilkan oleh Bacillus sp. khususnya keterlibatan disulfida reduktase ekstraseluler. Untuk mencapai tujuan tersebut maka penelitian ini dilaksanakan dalam empat tahap. Tahap pertama penelitian bertujuan memilih isolat Bacillus sp. yang menghasilkan keratinase dan disulfida reduktase ekstraseluler yaitu Bacillus licheniformis MB-2 dan Bacillus sp. MTS. B. licheniformis MB-2 adalah bakteri termofilik yang diisolasi dari sumber air panas Gn. Tompaso-Manado. Bakteri mesofilik Bacillus sp. MTS diisolasi dari tanah belerang Gn. Tangkuban Perahu- Bandung. Hasil penelitian menunjukkan Bacillus sp. MTS lebih efektif dan efisien dalam menghancurkan bulu ayam utuh dibandingkan B. licheniformis MB-2. Medium terbaik bagi Bacillus sp. MTS dalam menghasilkan disulfida reduktase adalah medium minimal, yaitu medium berisi berbagai garam mineral dan tepung bulu ayam, sedangkan medium terbaik bagi produksi keratinase adalah medium minimal + 0.02% tripton + 0.02% ekstrak kamir. Bacillus sp. MTS ditemukan menghasilkan keratinase dan disulfida reduktase baik di dalam cairan intraseluler maupun ekstraselulernya. Bacillus sp. MTS dipilih untuk digunakan pada penelitian tahap selanjutnya. Tahap kedua penelitian bertujuan melakukan karakterisasi keratinase dan disulfida reduktase ekstraseluler Bacillus sp. MTS. Temperatur dan pH optimum aktivitas keratinase adalah 55oC dengan pH 8.0, 10.0, dan pH 11.0, sedangkan disulfida reduktase pada 28oC dan pH 9.0. Analisis SDS-PAGE kultur bebas sel menunjukkan beberapa pita protein berukuran 17–60 kDa. Analisis zymografi fraksi amonium sulfat (50% b/v) yang telah didialisis menunjukkan bahwa Bacillus sp. MTS menghasilkan multi fraksi keratinase yang mampu menghidrolisis gelatin, yaitu protein berberat molekul 17, 25, 32, 53, 96, dan > 97 kDa. Molekul keratinase berukuran 25 kDa merupakan molekul yang paling stabil pada pH 8.0-11.0 dan temperatur 55-900 Tahap ketiga penelitian bertujuan melakukan pemurnian keratinase dan disulfida reduktase ekstraseluler Bacillus sp. MTS. Tahapan pemurnian 50% (b/v) amonium sulfat, dialisis, kromatografi Butyl Sepharose FF, dan kromatografi Sephacryl S-200HR dapat meningkatkan kemurnian keratinase dan disulfida reduktase. Diperoleh enam fraksi aktif keratinase dengan aktivitas spesifik bervariasi dari 10-37 U/mg dan tiga fraksi aktif disulfida reduktase dengan aktivitas 30-64 U/mg. Analisis SDS-PAGE fraksi dengan aktivitas keratinase tertinggi menampakkan tiga pita protein berukuran 53, 32, dan 17 kDa, sedangkan fraksi dengan aktivitas disulfida reduktase tertinggi dua pita berukuran 29 dan 17 kDa. Fraksi keratinase dan disulfida reduktase murni memiliki aktivitas optimum pada pH alkali (8.0-12.0). C, sedangkan molekul berukuran 35 dan 53 kDa adalah molekul yang paling tidak stabil. Tahap keempat penelitian bertujuan mengetahui keterlibatan disulfida reduktase, senyawa pereduksi dithiotreitol (DTT) dan β-merkaptoetanol (BMT), serta urea dalam degradasi keratin bulu ayam dan domba alami serta bulu ayam prehidrolisis NaOH. Aktivitas keratinase murni Bacillus sp. MTS dalam degradasi keratin ditingkatkan oleh keterlibatan disulfida reduktase murni. Aktivitas keratinase meningkat setelah substrat keratin direaksikan dengan disulfida reduktase; pada tepung bulu ayam prehidrolisis NaOH meningkat dari 5 U/mg menjadi 10.9 U/mg, tepung bulu ayam alami meningkat dari 4.5 U/mg menjadi 27.5 U/mg dan tepung bulu domba alami meningkat dari 8.7 U/mg menjadi 24.3 U/mg. Aktivitas bersama kedua enzim dari Bacillus sp. MTS lebih tinggi 10-20 kali dibandingkan dengan aktivitas bersama proteinase K dan disulfida reduktase, maupun proteinase K dengan senyawa pereduksi dan urea. Senyawa pereduksi 0.1 mM DTT meningkatkan kemampuan hidrolisis keratinase pada ketiga substrat keratin. Analisis Scanning Electron Microscopy (SEM) menampakkan lebih banyak kerusakan ditemukan pada permukaan selongsong bulu ayam yang diinkubasi dengan keratinase dan disulfida reduktase murni.

Keratin is insoluble and very stable protein. The disulphide bonds, hydrogen bonds and hydrophobic interaction within the polypeptide gives mechanical strength and also resistance to some protease enzyme. The main objective of this research was to study degradation of native chicken feather by keratinolytic enzymes from Bacillus sp., that is the role of keratinase and disulphide reductase, and this was conducted in four steps. The first step was conducted to select Bacillus sp. which produced extracellular keratinase and disulphide reductase. The isolates used were B. licheniformis MB-2 and Bacillus sp. MTS. The first isolate was a thermophillic bacterium screened from hot springs water of Mount Tompaso-Manado and the latter was mesophillic bacterium from sulphuric soil of Mount Tangkuban Perahu- Bandung. The result showed that Bacillus sp.MTS was more effective than B.licheniformis MB-2 for chicken feather degradation. A minimum medium which contained mineral salts was the best medium for Bacillus sp.MTS to secrete disulphide reductase, while the best medium for keratinase production was minimum medium with addition of 0.02% tripton and 0.02% yeast extract. Bacillus sp.MTS was found to secrete intracellular and extracellular keratinase and disulphide reductase and it was selected for further study. The second step was conducted to characterize the crude keratinase and disulphide reductase of Bacillus sp.MTS . The optimum temperature for keratinase and disulphide reductase were 55oC and 28oC respectively. Optimum pHs for keratinase were 8.0, 10.0 and 11.0, and optimum pH for disulphide reductase was 9.0. SDS-PAGE analysis of the culture-free cell showed 17 – 60 kD protein bands. Zymography analysis of ammonium sulphate fraction (50% w/v) showed that Bacillus sp.MTS secreted multy fraction keratinases of 17, 25, 32, 53, 96 and > 97 kD. The 25 kD keratinase was the most stable enzyme at pH 8.0-11.0 and temperature 55-900 The third step was to purify keratinase and disulphide reductase. Purification with ammonium sulphate 50% (w/v), dialysis, Butyl sepharose FF chromatography dan Sephacryl S-200HR chromatography could increase keratinase and disulphide purities, and gave six active keratinase with specific activity of 10 to 37 U/mg and three active disulphide reductase with specific activity of 30 to 64 U/mg. SDS-PAGE analysis of the highest activities of keratinase fractions showed molecular weights of 53, 32 and 17 kD. The highest activities of disulphide reductase fractions showed of 29 and 17 kD molecular weight. The purified keratinase and disulphide reductase had optimum activity at alkaline pHs (8.0-12.0). C while the 32 and 53 kD fractions were found as unstable. In the fourth step the role of disulphide reductase, reducing agent (DTT and BMT) and urea in hydrolysis of native chicken feather and sheep wool and NaOH prehydrolized chicken feather were studied. The activity of purified keratinase was increased by the presence of purified disulphide reductase.