Isolasi, pengklonan, dan konstruksi RNAi Gen Penyandi H+- ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum L.

Abstract

Melastoma malabathricum L. adalah suatu tanaman akumulator Al yang tumbuh pada tanah asam dengan tingkat kelarutan aluminium tinggi di daerah tropis. Salah satu enzim penting dalam detoksifikasi Al adalah H+-ATPase membran plasma, suatu protein yang paling melimpah pada membran plasma, yang disandikan oleh gen pma. Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi dan mengkarakterisasi gen yang menyandikan H+-ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum L. (Mmpma) dan mempelajari peranan gen Mmpma melalui konstruksi RNAi dengan menggunakan fragmen 3’UTR Mmpma. cDNA total telah berhasil disintesis dengan menggunakan transkripsi balik dengan RNA total sebagai cetakan. cDNA Mmpma utuh telah berhasil diisolasi melalui isolasi gen secara bertahap. Bagian ujung 5’ dan tengah gen Mmpma telah diisolasi dengan PCR (polymerase chain reaction) menggunakan cDNA total sebagai cetakan dan primer pma yang didesain dari beberapa tanaman, sedangkan bagian ujung 3’gen Mmpma telah diisolasi dengan 3’ RACE. Bagian-bagian gen tersebut telah berhasil digabung menggunakan PCR dan telah disisipkan ke dalam pGEMT Easy. Plasmid rekombinan tersebut telah berhasil diintroduksikan ke dalam E. coli DH5a. Analisis sekuen nukleotida menunjukkan bahwa panjang sekuen penyandi (CDS) Mmpma adalah 2871 pb yang menyandikan 956 asam amino dengan prediksi berat molekul 105.29 kDa dan prediksi nilai pI sekitar 6.84. MmPMA mempunyai 10 domain transmembran, 4 loop sitoplasma, 6 domain fungsional dan 3 domain autoregulator. Pada loop sitoplasma kedua (C2) terdapat sekuen terkonservasi TGES (domain aktivitas fosfatase); pada C3 terdapat sekuen DKTGTLT (domain fosforilasi dan transduksi), KGAP (domain pengikatan ATP dan/atau aktivitas kinase), DPPR (domain pengikatan ATP), MITGD (domain pengikatan ATP) dan GDGVNDAPALK (domain pengikatan ATP); pada C4 terdapat 3 domain autoregulator yang masing-masing mempunyai sekuen: QKDFGKEQRELQWAHAQRTLHGL, NHIAEEAKRRAEIARL, dan YTV. Analisis kesejajaran lokal berdasarkan nukleotida mRNA menunjukkan bahwa Mmpma mempunyai kemiripan 82% dengan pma Vitis vinifera; 81% dengan pma Juglans regia, pma Populus tricocarpa, pma Sesbania rostrata, dan pma Prunus persica dan 80% dengan pma Lycopersicon esculentum. Berdasarkan deduksi sekuen asam amino, MmPMA mempunyai kemiripan 94% dengan PMA Vitis vinifera dan PMA Juglans regia; 93% dengan PMA Populus trichocarpa; 92% dengan PMA Vicia faba, Lycopersicon esculentum, Solanum tuberosum, dan Arabidopsis thaliana.