Isolasi Gen Yang Terlibat Dalam Pelarutan Fosfat Dari Pseudomonas sp.AZM-1 Melalui Mutagenesis Dengan Transposon

Abstract

Pseudomonas sp.AZM-1 adalah mikroba tanah yang memiliki kemampuan dalam pelarutan fosfat melalui mekanisme enzimatik sehingga bakteri ini memiliki gen yang berhubungan dengan pelarutan fosfat. Mikroba gram negatif ini memiliki respon positif terhadap transposon mini Tn5Km1. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi, mengklon dan mengkarakterisasi gen yang terlibat dalam pelarutan fosfat. Penelitian ini dimulai dengan mengisolasi bakteri pelarut fosfat, isolasi fragmen DNA genom dari mutan negatif pelarut, amplifikasi fragmen DNA pengapit menggunakan inverse PCR, pengklonan fragmen hasil PCR pada pGEM®-T Easy, introduksi plasmid ke dalam bakteri E. coli galur DH5α. Fragmen DNA vector rekombinan dari mutan negatif pelarut fosfat yang didapat di sekuen dengan menggunakan primer T7 dan SP6. Untuk mengisolasi gen yang terlibat dalam pelarutan fosfat, bakteri ini dimutasikan dengan transposon mini Tn5Km1 sehingga menjadi bakteri mutan yang tidak mampu melarutkan fosfat. Introduksi transposon dilakukan melalui konjugasi antara Pseudomonas sp.AZM-1 dengan E. coli S17 (λ pir) yang mengandung pUT mini–Tn5Km1. Frekuensi transkonjugasi sel bakteri mutan negatif pelarut fosfat didapatkan dari media sebar adalah 3.00 x 10-9. Bakteri mutan ini tidak dapat melarutkan fosfat di dalam media pykovskaya. Fragmen DNA yang tersisipi transposon diisolasi dengan cara Polymerase Chain Reaction terbalik (inverse PCR) dan diklon ke dalam pGEM®-T Easy. Analisis mutan menunjukkan bahwa DNA pengapit transposon berukuran 1006 pb dan mengandung kerangka baca (Open Reading Frame). Kerangka baca ini mengandung 215 asam amino. Analisis penyejajaran urutan nukleotida dan asam amino yang menggunakan program BLAST X, menunjukkan bahwa fragmen tersebut adalah endonuklease 1 yang memiliki kesamaan genom dengan Pseudomonas fluorescens Pf-5. Analisis kesejajaran dari urutan asam amino yang dideduksi dari ORF ini menunjukkan bahwa ORF ini memiliki kesamaan dengan DNAse1 yang disandikan oleh gen endA dari Pseudomonas fluorescens galur Pf-5. Gen ini mungkin secara tidak langsung dalam pelarutan fosfat di dalam Pseudomonas sp. AZM-1.