Toksisitas Insektisida dan Karakterisasi Gen Penyandi Imunitas pada Lebah Tanpa Sengat Tetragonula laeviceps Smith, 1857

Abstract

Tetragonula laeviceps merupakan lebah yang banyak dibudidayakan di Indonesia yang sangat penting dalam memberikan layanan ekologi sebagai penyerbuk tanaman, termasuk pada tanaman budi daya. Namun, akhir-akhir ini populasi lebah di dunia mengalami penurunan dan penggunaan insektisida secara intensif saat budi daya tanaman diduga menjadi salah satu penyebabnya. Penelitian ini bertujuan menganalisis pengaruh dari senyawa volatil pada insektisida terhadap perilaku preferensi kunjungan lebah T. laeviceps, menganalisis tingkat toksisitas insektisida melalui paparan dermal dan oral, menganalisis pengaruh paparan insektisida terhadap kemampuan makan lebah T. laeviceps, dan mengkarakterisasi 2 gen penyandi imunitas lebah T. laeviceps, yaitu gen defensin 1 dan abaecin. Insektisida berbahan aktif karbosulfan, klotianidin, diafentiuron, dan tetraniliprol diuji toksisitasnya terhadap T. laeviceps melalui paparan dermal dan oral pada lima taraf konsentrasi insektisida. Sementara itu, pengujian preferensi lebah T. laeviceps dilakukan melalui uji olfaktori menggunakan tabung-Y olfaktometer. DNA lebah T. laeviceps diekstraksi menggunakan metode ekstraksi GeneAid DNA Mini KIT dan pengendapan etanol serta diamplifikasi menggunakan primer berdasarkan primer untuk lebah Apis mellifera. Hasil penelitian ini memberikan informasi mengenai tingkat toksisitas dan pengaruh keempat insektisida pada lebah T. laeviceps serta karakterisasi gen defensin 1 dan abaecin sebagai gen penyandi imunitas lebah yang dapat dimanfaatkan sebagai dasar untuk upaya penggunaan insektisida yang lebih peduli terhadap keberlangsungan hidup lebah di sekitar area pertanian. Hasil penelitian menunjukkan bahwa paparan insektisida memengaruhi durasi kunjungan lebah T. laeviceps (p = 0,006), tetapi tidak memengaruhi frekuensi kunjungannya (p = 0,286). Tingkat toksisitas insektisida karbosulfan dan klotianidin tergolong ke dalam insektisida yang sangat toksik dan berbahaya, sedangkan diafentiuron dan tetraniliprol tergolong ke dalam insektisida yang tidak berbahaya bagi lebah T. laeviceps. Karbosulfan dan klotianidin bersifat toksik terhadap lebah T. laeviceps, baik secara dermal (LC50 berturut-turut 31,285 dan 0,092 ppm) maupun oral (LC50 berturut-turut 28,511 dan 0,410 ppm). Selain itu, kemampuan lebah untuk mengonsumsi pakan juga menurun secara signifikan akibat adanya paparan insektisida karbosulfan (10 000 dan 3000 ppm) dan klotianidin (300; 30; 3; 0,3; dan 0,03 ppm). Insektisida dapat mengurangi kelangsungan hidup dan mengubah sistem fisiologis yang selanjutnya berdampak pada penurunan imunitas dan perubahan perilaku lebah. Gen penyandi imunitas, defensin 1 dan abaecin, yang diperoleh pada penelitian ini hanya sebagian dari sekuen total. Fragmen gen defensin 1 yang diperoleh sebesar 283 pb mencakup sebagian ekson 2, intron 2, dan ekson 3. Panjang ekson 2, intron 2, dan ekson 3 pada sekuen DNA gen defensin 1 secara berturut-turut adalah 73, 160, dan 40 pb. Gen defensin 1 pada ekson 2 dan 3 menghasilkan peptida sepanjang 36 asam amino dengan 5 asam amino sistein. Motif protein khas defensin 1 tidak dapat diidentifikasi karena hanya 5 residu sistein yang diperoleh pada ekson 2 yang seharusnya berjumlah 6 untuk pembentukan struktur motif ikatan disulfida yang lengkap. Konstruksi filogenetik gen defensin 1 menunjukkan T. laeviceps berkerabat dekat dengan M. bicolor dibandingkan dengan lebah madu. Sementara itu, hanya 30 pb gen abaecin T. laeviceps pada ekson 2 yang diperoleh dan menghasilkan 9 asam amino dengan kandungan prolin yang tinggi. Variasi nukleotida terbanyak terjadi antara T. laeviceps dan M. quadrifasciata sebanyak 6 bp, tetapi tidak menyebabkan perbedaan asam amino. Konstruksi filogenetik gen abaecin berdasarkan sekuen nukleotida menunjukkan T. laeviceps berkerabat dekat dengan lebah madu dibandingkan dengan M. quadrifasciata, tetapi berkerabat dengan dengan M. quadrifasciata berdasarkan sekuen asam amino yang mengindikasikan konservasi protein.

Tetragonula laeviceps is widely reared in meliponiculture in Indonesia and plays a crucial role in providing ecological services as pollinators of plants, including cultivated crops. However, in recent years, global bee populations have been in decline, and the intensive use of insecticides in agricultural practices is suspected to be one of the causes. So, this study aimed to examine the effects of volatile compounds from insecticides on the visitation preference behavior of T. laeviceps, analyze the toxicity level of insecticides through dermal and oral exposure, evaluate the effects of insecticide exposure on the feeding ability of T. laeviceps, and characterize two immune-related genes in T. laeviceps, namely the defensin 1 and abaecin genes. Four insecticide active ingredients, carbosulfan, clothianidin, diafenthiuron, and tetraniliprole, were tested for toxicity against T. laeviceps through dermal and oral exposures at five concentration levels. Meanwhile, bee preference testing was conducted through olfactory tests using a Ytube olfactometer. DNA in T. laeviceps were extracted using the GeneAid DNA Mini Kit and ethanol precipitation methods. It is amplified using primers based on the primer for Apis mellifera. The findings of this research provide insights into the toxicity levels and effects of the four insecticides on T. laeviceps, as well as the characterization of the defensin 1 and abaecin genes as immune-related genes. These results may serve as a basis for promoting the use of more bee-friendly insecticides in agricultural areas. The results showed that insecticide exposure affected the visitation length of T. laeviceps (p = 0.006), but not its visitation frequency (p = 0.286). The toxicity levels of the insecticides carbosulfan and clothianidin are classified as highly toxic and hazardous, while diafentiuron and tetraniliprole are non-hazardous to T. laeviceps bees. Both carbosulfan and clothianidin exhibited toxicity toward T. laeviceps, through dermal (LC50: 31.285 and 0.092 ppm, respectively) and oral exposure (LC50: 28.511 and 0.410 ppm, respectively). In addition, the capability of bees to consume feed was also significantly decreased due to exposure to carbosulfan (10 000 and 3000 ppm) and clothianidin (300; 30; 3; 0.3; and 0.03 ppm) insecticides. Insecticide exposure can reduce bee survival and change physiological systems, which impacts immunity and alters bee behavior. The immunity-related genes, defensin 1 and abaecin, obtained in this study represent only partial sequences of the full genes. The fragment of the defensin 1 gene obtained was 283 bp, encompassing part of exon 2, intron 2, and exon 3. The lengths of exon 2, intron 2, and exon 3 in the defensin 1 DNA sequence were 73, 160, and 40 bp, respectively. The defensin 1 gene spanning exons 2 and 3 encodes a peptide of 36 amino acids containing five cysteine residues. The characteristic protein motif of defensin 1 could not be identified because only five cysteine residues were obtained in exon 2, whereas six cysteines are normally required to form a complete disulfide-bonded structural motif. Phylogenetic relationship of the defensin 1 gene indicated that T. laeviceps is closely related to M. bicolor compared to the honeybees. Only a 30 bp fragment of the abaecin gene from exon 2 of T. laeviceps was obtained, encoding 9 amino acids with a high proline content. The highest nucleotide variation occurred between T. laeviceps and M. quadrifasciata with 6 bp, but this did not result in any amino acid changes. Phylogenetic relationship of the abaecin gene based on nucleotide sequences showed that T. laeviceps is closely related to honeybees compared to M. quadrifasciata, whereas analysis based on amino acid sequences indicated a closer relationship with M. quadrifasciata, reflecting protein conservation.