Characteristics of the Coat Color and Its Relationship With Melanocortin 1 Receptor (MC1R) In the Papuan Bandicoot (Echymipera kalubu)

Abstract

Coat color is a highly variable morphological trait in animals and plays a crucial role in various adaptive functions such as camouflage, communication, sexual selection, and thermoregulation. In many mammalian species, color variation is influenced by the expression and mutation of multiple pigmentation-related genes, one of which is the Melanocortin 1 Receptor (MC1R). MC1R encodes a receptor protein that regulates the production of two primary types of melanin: eumelanin (black/brown) and pheomelanin (red/yellow). Activation of MC1R by the a-MSH hormone enhances eumelanin production via the cAMP signaling pathway. Research on MC1R has largely focused on placental mammals, while information on marsupials remains scarce. The Papuan bandicoot (Echymipera kalubu), a marsupial endemic to Papua, exhibits striking intraspecific variation in ventral hair color. Some individuals display reddish-yellow ventral hair, while others have white-grey coloration. This study aims to identify phenotypic hair color variation and hair color banding patterns, analyze the genetic characteristics of MC1R in the two-color morphs, and evaluate the functional association between MC1R variants and hair color through cAMP signaling assays. A total of 20 E. kalubu individuals were collected from Manokwari, West Papua. Hair color was analysed quantitatively using the CIE Lab* method and calibrated photography across three body regions (dorsal, lateral, ventral), while hair shafts were examined microscopically to identify seven banding types based on eumelanin and pheomelanin distribution. Habitat soil color was measured to assess body-background color matching. Results revealed two distinct phenotypic groups, red-ventral and white-ventral, with significant differences in Lab* and Chroma values, particularly in the ventral area. Red-ventral individuals had higher a* and b* values and lower L* values, indicating darker, redder coloration; they also exhibited a greater diversity of hair banding types (T3–T5) and were found in darker, reddish habitats. In contrast, white-ventral individuals displayed predominantly light-colored banding (T6–T7) and inhabited more open areas with lighter soil substrates, supporting the hypotheses of countershading and background matching. Genetic characterisation showed that the E. kalubu MC1R gene consists of a single exon spanning 951 bp, encoding a 317 amino acid protein. Three nucleotide polymorphisms were identified, including two synonymous mutations (T201C and C471T) and one non-synonymous substitution (G668A), resulting in an R223Q amino acid change. The R223 variant was found only in red ventral individuals, while Q223 occurred exclusively in white ventral individuals. Functional analysis showed that cAMP signaling upon a-MSH stimulation occurred in a dose-dependent manner response was weak, but significantly in haplotype A (R223) than haplotype C (Q223) displaying a relatively flat response curve. Basal activity was higher and significant in haplotype A than in haplotype C. Maximum activity and EC50 values did not differ significantly between the haplotypes. The R223Q mutation is located at the end of TM5, near IL3, a key region for interaction with the Gs protein. This position contributes to receptor conformation stability through interactions with the Gß subunit and Ca²? ions, both essential for efficient hormone recognition and signal transduction. These findings indicate that the location of the mutation combined with basal activity may underlie the observed variation in ventral coat color in E. kalubu. These findings imply that ventral color differences are not solely determined by MC1R function and may involve downstream ERK/MAPK and other pathways and other genes such as ASIP. Overall, E. kalubu represents a promising animal model for studying the evolution of hair coloration, pigmentation mechanisms, and ecological adaptation in nonplacental mammals.

Warna rambut merupakan salah satu sifat morfologis yang sangat bervariasi pada hewan dan memainkan peran penting dalam berbagai fungsi adaptif seperti kamuflase, komunikasi, seleksi seksual, dan termoregulasi. Pada banyak spesies mamalia, variasi warna ini dipengaruhi oleh ekspresi dan mutasi pada berbagai gen pigmentasi, salah satunya adalah Melanocortin 1 Receptor (MC1R), yang mengkode reseptor protein pengatur produksi dua tipe utama pigmen melanin: eumelanin (hitam/coklat) dan feomelanin (merah/kuning). Aktivasi MC1R oleh hormon a-MSH meningkatkan produksi eumelanin melalui jalur pensinyalan cAMP. Hingga kini, studi mengenai MC1R sebagian besar terbatas pada mamalia plasental, sementara informasi pada marsupial masih minim. Bandikut Papua (E. kalubu), marsupial endemik dari Papua, menunjukkan variasi warna ventral yang mencolok beberapa individu berwarna merah kekuningan dan lainnya putih keabu-abuan. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi variasi fenotip warna rambut dan pola pita warna rambut, menganalisis karakter genetik MC1R pada dua kelompok warna tersebut, serta mengevaluasi keterkaitan fungsional antara varian MC1R dengan warna rambut melalui uji pensinyalan cAMP. Sebanyak 20 individu E. kalubu dikoleksi dari Manokwari, Papua Barat. Warna rambut dianalisis secara kuantitatif menggunakan metode CIE Lab* dan fotografi terkalibrasi pada tiga area tubuh (dorsal, lateral, ventral), sementara rambut diamati secara mikroskopis untuk mengidentifikasi tujuh tipe pita warna berdasarkan distribusi eumelanin dan feomelanin. Pengukuran warna substrat tanah habitat dilakukan untuk mengevaluasi kesesuaian warna tubuh dengan latar belakang (background matching). Hasil menunjukkan dua kelompok fenotipe yang jelas, yaitu ventral-merah dan ventral-putih, dengan perbedaan signifikan pada nilai Lab*, dan Chroma, terutama di area ventral. Kelompok ventral-merah memiliki nilai a* dan b* lebih tinggi, serta L* lebih rendah, mencerminkan warna lebih merah dan gelap; mereka juga menunjukkan keragaman pita warna rambut lebih banyak (T3–T5), dan hidup di habitat dengan tanah lebih gelap dan kemerahan. Sebaliknya, kelompok ventral-putih menunjukkan dominasi pita rambut terang (T6–T7) dan menghuni area lebih terbuka dengan substrat tanah yang lebih cerah, mendukung hipotesis countershading dan background matching. Karakterisasi genetik menunjukkan bahwa gen MC1R pada E. kalubu terdiri atas satu ekson sepanjang 951 bp yang menyandi 317 asam amino. Ditemukan tiga polimorfisme nukleotida, dua bersifat sinonim (T201C dan C471T), dan satu non-sinonim (G668A), yang menyebabkan substitusi asam amino R223Q. Varian R223 hanya ditemukan pada individu ventral-merah, sementara Q223 hanya pada ventral-putih, menunjukkan asosiasi kuat dengan fenotipe warna. Analisis fungsional menunjukkan bahwa sinyal cAMP akibat stimulasi a-MSH terjadi secara tergantung dosis pada haplotipe A (R223), meskipun keduanya responsnya lemah namun Haplotype A (R223) berbeda signifikan dibandingkan haplotipe C (Q223), dengan kurva respons yang relatif datar. Aktivitas basal lebih tinggi pada haplotipe A dibandingkan haplotipe C, secara signifikan. Aktivitas maksimum dan nilai EC50 tidak berbeda secara signifikan antara kedua haplotipe. Lokasi mutasi R223Q di ujung TM5, dekat IL3 situs kritis untuk interaksi protein G menunjukkan bahwa mutasi ini mungkin berperan dalam regulasi alternatif atau interaksi protein lainnya. Temuan ini menunjukkan bahwa lokasi mutasi, dikombinasikan dengan produksi basal cAMP, dapat menjadi dasar variasi warna bulu ventral yang diamati pada E. kalubu. Selain itu perbedaan warna ventral tidak sepenuhnya dijelaskan oleh fungsi MC1R, dan kemungkinan melibatkan gen atau jalur pensinyalan downstream ERK/MAPK dan lainnya serta keteribatan gen lain seperti ASIP. Secara keseluruhan, E. kalubu merupakan model hewan yang potensial untuk mempelajari mekanisme evolusi warna rambut, pigmentasi, dan adaptasi ekologis pada mamalia non-plasental.