Pengembangan Marka SNAP Multipleks Berbasis Gen Pengendali Hasil Tinggi dan Ketahanan Hawar Daun Bakteri pada Tanaman Padi

Abstract

Pemanasan global menjadi ancaman dalam produksi padi di Indonesia karena lahan produktif semakin berkurang dan meningkatnya serangan hama dan penyakit, seperti hawar daun bakteri (HDB). Salah satu upaya yang dilakukan adalah perbaikan genetik tanaman padi menggunakan varietas nasional Inpari 32 yang membawa gen ketahanan HDB dan Code-qTSN4 yang membawa gen produktivitas tinggi dalam pembentukan populasi persilangan. Set marka molekuler berbasis simple sequence repeat (SSR) dan sequence-tagged site (STS) spesifik untuk gen qTSN4 terkait produktivitas, serta xa5 dan Xa21 terkait ketahanan HDB telah digunakan dalam seleksi individu yang membawa gen target dalam populasi tersebut. Akan tetapi, marka SSR dan STS sulit diamati dengan sistem sederhana dan posisinya dengan gen qTSN4 dan Xa masih jauh. Marka single nucleotide amplified polymorphism (SNAP) menjadi solusi karena menggunakan sistem sederhana dan letaknya dapat berada dekat atau di dalam gen target. Kelemahan sistem SNAP yang hanya mengandalkan ada atau tidaknya produk PCR adalah ketidakmampuan membedakan antara kegagalan PCR dan kinerja primer spesifik, sehingga diperlukan reaksi multipleks dengan sepasang primer kontrol internal seperti gen elongation factor-1a (EF1-a) untuk memastikan PCR berjalan lancar. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan mengembangkan marka SNAP multipleks berbasis gen qTSN4 dan Xa untuk akselerasi dan akurasi seleksi galur padi dengan produktivitas tinggi dan ketahanan terhadap HDB. Penelitian terdiri atas dua percobaan. Percobaan pertama bertujuan merancang primer SNAP berbasis gen qTSN4, xa5, dan Xa21, serta mengoptimasi reaksi PCR SNAP multipleks dengan primer spesifik gen EF1-?. Keberadaan SNP pada Gen qTSN4, xa5, dan Xa21 berhasil diidentifikasi melalui penyejajaran sekuens gen-gen tersebut dari genotipe padi yang telah dilaporkan sebelumnya. Tiga lokus SNP non synonymous, yaitu Spike 1 (G/A pada posisi ekson 2), Spike 2 (C/T pada posisi ekson 4), dan Spike 3 (G/A pada posisi ekson 4), berhasil diidentifikasi dengan menyejajarkan gen qTSN4 dari genom padi IR64 dan Japonica. Penyejajaran gen xa5 dari genom padi Nipponbare, IR24, dan IRBB5 mengidentifikasi dua lokus SNP yang bersebelahan (TC/AG) pada posisi ekson 1 yang menyebabkan translasi non synonymous, sedangkan penyejajaran gen Xa21 dari genom padi IR64 dengan IRBB21 mengidentifikasi satu lokus SNP (T/C pada posisi ekson 1) yang bersifat synonymous. Dua primer spesifik masing-masing alel dengan tambahan mismatch pada posisi kedua sebelum lokasi SNP dan satu primer universal berhasil dirancang pada ketiga gen tersebut dengan kualitas persen GC optimal serta pembentukan hairpin, self-dimer, dan heterodimer dengan peluang yang kecil. Suhu annealing 60oC dan konsentrasi primer EF1-a sebesar 0,5 µM menghasilkan produk yang jelas antara produk primer SNAP dan kontrol internal PCR. Reaksi tersebut mampu membuktikan bahwa Code-qTSN4, IRBB5, dan IRBB21 masing-masing mempunyai genotipe positif untuk gen qTSN4, xa5, dan Xa21. Percobaan kedua dilakukan untuk menguji kemampuan marka SNAP yang dirancang pada percobaan pertama dalam membedakan tetua Inpari 32 dan Code qTSN4 yang digunakan dalam pembentukan populasi F2 dan BC1F1. Setelah itu, marka SNAP digunakan untuk kegiatan seleksi individu tanaman yang membawa alel positif untuk gen-gen tersebut pada populasi F2 dan BC1F1. Hasil percobaan kedua menunjukkan bahwa Inpari 32 terbukti mempunyai genotipe positif untuk Xa21, serta tidak mempunyai genotipe positif untuk xa5 dan qTSN4, sedangkan Code-qTSN4 hanya mempunyai genotipe positif untuk qTSN4. Hanya marka SNAP qTSN4 dan Xa21 yang dapat digunakan untuk seleksi karena bersifat polimorfik untuk kedua tetua. Marka SNAP gen qTSN4 dan Xa21 menunjukkan pola sesuai dengan hukum Mendel, yaitu 1:2:1 pada populasi F2. Genotipe yang diseleksi adalah genotipe heterozigot dan homozigot untuk alel positif A gen qTSN4 dan alel positif C gen Xa21. Penelitian ini mengidentifikasi 94 tanaman dengan alel positif untuk kedua gen tersebut dengan potensi mempunyai produktivitas dan ketahanan HDB yang perlu diuji lebih lanjut. Populasi BC1F1 menunjukkan pola yang sesuai dengan hukum Mendel 1:1 dengan marka SNAP gen qTSN4 dan Xa21. Marka SNAP qTSN4 dan Xa21 merupakan marka untuk seleksi foreground. Genotipe yang diseleksi hanya bentuk heterozigot untuk qTSN4 dan genotipe homozigot CC untuk Xa21. Kedua marka ini dapat menyeleksi sebanyak 18 tanaman. Dengan demikian, genotipe tanaman yang terseleksi membawa genotipe target pada kedua populasi yang dapat dikembangkan menjadi generasi lebih lanjut sampai menghasilkan calon varietas baru dengan produktivitas tinggi serta ketahanan HDB.

Global warming poses a threat to rice production in Indonesia due to the decreasing availability of productive land and the increasing incidence of pests and diseases, such as bacterial leaf blight (BLB). One of the efforts undertaken is the genetic improvement of rice plants using the national variety Inpari 32, which carries the BLB resistance gene, and Code-qTSN4, which carries a high-yield gene, in the formation of a crossing population. A set of molecular markers based on simple sequence repeat (SSR) and sequence-tagged site (STS) specific to the qTSN4 gene related to productivity, as well as xa5 and Xa21 related to BLB resistance, have been used to select individuals carrying the target genes in the population. However, SSR and STS markers are difficult to detect using simple systems and are located far from the qTSN4 and Xa genes. Single nucleotide amplified polymorphism (SNAP) markers offer a solution due to their simplicity and proximity to or within the target genes. The weakness of the SNAP system, which relies solely on the presence or absence of PCR products, is its inability to distinguish between PCR failure and specific primer performance, thus requiring a multiplex reaction with a pair of internal control primers, one of which the elongation factor-1a (EF1-a) gene to ensure successful PCR. Therefore, this study aims to develop multiplex SNAP markers based on the qTSN4 and Xa genes to accelerate and improve the accuracy of selecting rice lines with high productivity and resistance to BLB. The study consisted of two experiments. The first experiment aimed to design SNAP primers based on the qTSN4, xa5, and Xa21 genes, and to optimize the multiplex SNAP PCR reaction using specific primers for the EF1-a gene. The presence of SNPs in the qTSN4, xa5, and Xa21 genes was successfully identified through sequence alignment of these genes from previously reported rice genotypes. Three non-synonymous SNP loci—Spike 1 (G/A at exon 2), Spike 2 (C/T at exon 4), and Spike 3 (G/A at exon 4)—were identified by aligning the qTSN4 gene from the IR64 and Japonica rice genomes. Alignment of the xa5 gene from the Nipponbare, IR24, and IRBB5 rice genomes identified two adjacent SNP loci (TC/AG) at exon 1 that result in non-synonymous translation, while alignment of the Xa21 gene from the IR64 and IRBB21 genomes identified one synonymous SNP locus (T/C at exon 1). Two allele-specific primers with an added mismatch at the second position before the SNP site and one universal primer were successfully designed for each of the three genes, with optimal GC content and minimal potential for hairpin, self-dimer, and heterodimer formation. An annealing temperature of 60 °C and EF1-a primer concentration of 0.5 µM produced clear products between the SNAP primers and the internal PCR control. This reaction confirmed that Code-qTSN4, IRBB5, and IRBB21 each had positive genotypes for the qTSN4, xa5, and Xa21 genes. The second experiment was conducted to test the ability of the SNAP markers designed in the first experiment to distinguish the parental lines Inpari 32 and Code qTSN4 used in the formation of F2 and BC1F1 populations. Subsequently, the SNAP markers were used to select individual plants carrying positive alleles for these genes in the F2 and BC1F1 populations. The results of the second experiment showed that Inpari 32 had a positive genotype for Xa21, but not for xa5 and qTSN4, while Code qTSN4 had a positive genotype only for qTSN4. Only the SNAP markers for qTSN4 and Xa21 could be used for selection because they were polymorphic between the two parental lines. The SNAP markers for qTSN4 and Xa21 showed patterns consistent with Mendelian inheritance, namely 1:2:1 in the F2 population. The selected genotypes were heterozygous and homozygous for the positive allele A of the qTSN4 gene and the positive allele C of the Xa21 gene. This study identified 94 plants with positive alleles for both genes, which have the potential for high productivity and BLB resistance and require further testing. The BC1F1 population showed a 1:1 Mendelian pattern with the SNAP markers for qTSN4 and Xa21. The SNAP markers for qTSN4 and Xa21 served as foreground selection markers. The selected genotypes were only heterozygous for qTSN4 and homozygous CC genotype for Xa21. These two markers were able to select 18 plants. Thus, the selected plant genotypes carry the target genotypes in both populations and can be developed into subsequent generations to produce new candidate varieties with high productivity and BLB resistance