Rekayasa Genetik Tanaman Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar IPB CP2 dengan Gen OsGERLP.

Abstract

Tanaman kentang merupakan salah satu komoditas pangan utama sumber karbohidrat keempat setelah padi, gandum dan jagung di dunia. Kebutuan akan umbi kentang semakin meningkat dengan bertambahnya penduduk dan sebakin baiknya kualitas hidup manusia. Area penanaman kentang di Indonesia terutama terdapat di dataran tinggi dengan lahan yang semakin terbatas karena bersaing dengan komiditas hortikultura lainnya. Salah satu alternatif pemecahan masalah tersebut adalah perluasan area tanam ke lahan marginal seperti lahan konversi perkebunan teh. Namun lahan tersebut bersifat masam dan memiliki kandungan aluminum (Al) terlarut yang tinggi dan toksik bagi tanaman. Produktivitas umbi kentang sangat dipengaruhi langsung oleh sifat tanah, termasuk keasaman tanah dan keracunan Al. Salah satu upaya untuk mengatasi masalah tersebut adalah dengan memanfaatkan kultivar toleran tanah masam dan cakaman Al. Rekayasa genetik menjadi pendekatan alternatif untuk memperbaiki karakter tanaman dengan mengintroduksikan gen ke dalam sel tanaman melalui mediasi bakteri Agrobacterium tumefaciens yang telah membawa gen yang diinginkan. Penelitian sebelumnya telah menemukan Oryza sativa Gene Encoding Ribosomal like L32 Protein (OsGERLP) berasal dari padi lokal Hawara Bunar sebagai pengatur gen toleransi Al dan berpotensi untuk pengembangan tanaman toleran Al. Gen tersebut telah diuji pada tanaman padi dan tembakau yang menghasilkan tanaman transgenik yang tumbuh lebih baik dan toleran terhadap tanah masam dan cekaman Al. Kentang kultivar IPB CP2 adalah salah satu ultivar kentang industri (french fries) yang dikembangkan oleh Pusat Bioteknologi IPB. Kentang ini belum diketahui toleransinya terhadap cekaman Al, sehingga perlu dilakukan peningkatan kemampuan toleransi kultivar IPB CP2 terhadap cekaman Al melalui rekayasa genetik dengan gen OsGERLP. Diharapkan tanaman transgenik yang dihasilkan akan dapat digunakan dalam pengembangan kultivar baru tanaman kentang yang bisa beradaptasi terhadap lahan-lahan marginal seperti tanah masam berkadar Al tinggi. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan rekayasa genetik tanaman kentang kultivar IPB CP2 yang diintroduksi gen OsGERLP melalui bantuan bakteri A. tumefaciens. Tahapan dari penelitian ini meliputi 1) multiplikasi tanaman kentang secara in vitro, 2) kultur bakteri A. tumefaciens, 3) transformasi genetik yang dimediasi oleh A. tumefaciens, 4) analisis integritas DNA genom dan integrasi gen OsGERLP, 5) seleksi, regenerasi, dan perbanyakan tunas, 6) pengujian toleransi tanaman transgenik terhadap cekaman Al. Parameter morfologi diukur menggunakan software Fiji-ImageJ dengan plugin SmartRoot untuk mengukur panjang akar total. Data morfologi pengujian toleransi dianalisis dengan Two-way ANOVA menggunakan software R Studio. Jika terdapat beda nyata, maka dilakukan uji lanjut dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada a = 0,05.

ii Introduksi gen OsGERLP melalui mediasi A. tumefaciens telah dilakukan dan menghasilkan tanaman putatif transgenik dengan efisiensi transformasi dan regenerasi masing-masing sebesar 72,62 dan 17,24% pada eksplan daun serta 71,3 dan 87,65% pada eksplan ruas batang. DNA total dari 7 klon tanaman putatif transgenik yang telah berhasil diisolasi, dianalisis integritas DNA dengan melakukan amplifikasi gen aktin (houskeeping gene). Hasil amplifikasi dengan gen aktin menggunakan primer Act-F dan Act-R menghasilkan amplikon berkisar 400 bp yang menandakan bahwa DNA yang diisolasi memiliki integrasi yang baik ddan layak untuk dijadikan template reaksi polymerase chain reaction (PCR). Analisis integrasi gen pada tanaman transgenik menunjukkan bahwa semua klon transgenik mengandung gen OsGERLP di bawah kendali promoter 35SCaMV, yang ditandai dengan terbentuknya amplikon berukuran 1500 bp. Pengujian toleransi klon transgenik terhadap cekaman Al secara in vitro menunjukkan bahwa klon transgenik memiliki toleransi yang lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman non-transgenik. Hasil pengamatan morfologi menunjukkan bahwa klon transgenik menunjukkan performa yang lebih baik pada semua parameter yang diamati, meliputi tinggi tanaman, panjang akar total, jumlah akar, bobot segar pucuk dan akar, serta bobot kering pucuk dan akar. Dua klon transgenic, CP2OsG2 dan CP2OsG3, memiliki toleransi yang paling baik terhadap cekaman Al dibandingkan klon lainnya. Kedua klon tersebut berpotensi untuk dikembangkan menjadi varietas kentang toleran cekaman Al yang dapat beradaptasi pada tanah masam.

Kata kunci: Agrobacterium tumefaciens, cekaman Al, gen OsGERLP, kentang kultivar IPB CP2, transformasi genetik

Potato is the fourth major carbohydrate food commodity after rice, wheat and corn in the world. The demand for potato tubers is increasing as the population grows and the quality of human life improves. Potato growing areas in Indonesia are mainly in the highlands with increasingly limited land due to competition with other horticultural commodities. One alternative solution to this problem is to expand the planting area to marginal lands such as tea plantation conversion lands. However, these lands are acidic and have high dissolved aluminum (Al) content which is toxic to plants. Potato tuber productivity is directly affected by soil properties, including soil acidity and Al toxicity. One way to overcome these problems is to utilize acid and Al tolerant cultivars.

Genetic engineering serves as an alternative approach to improve plant characteristics by introducing genes into plant cells through mediation of Agrobacterium tumefaciens bacteria that carry the desired genes. Previous research has identified the Oryza sativa Gene Encoding Ribosomal like L32 Protein (OsGERLP) from local rice Hawara Bunar as a regulator gene for Al tolerance and potentially useful for developing Al-tolerant plants. This gene has been tested on rice and tobacco plants, producing transgenic plants that grow better and are tolerant to acidic soils and Al stress.

Potato cultivar IPB CP2 is one of the industrial potato cultivars (french fries) developed by the IPB Biotechnology Center. The tolerance of this potato to Al stress is not yet known, thus requiring enhancement of the tolerance capability of IPB CP2 cultivar to Al stress through genetic engineering with the OsGERLP gene. It is expected that the resulting transgenic plants can be used in developing new potato cultivars that can adapt to marginal lands such as acidic soils with high Al content. This research aims to conduct genetic engineering of potato plants cultivar IPB CP2 introduced with the OsGERLP gene through A. tumefaciens mediation.

The stages of this research include: 1) in vitro multiplication of potato plants, 2) culture of A. tumefaciens bacteria, 3) Genetic transformation mediated by A. tumefaciens, 4) analysis of genomic DNA integrity and OsGERLP gene integration, 5) selection, regeneration, and shoot multiplication, 6) testing of transgenic plant tolerance to al stress. Morphological parameters were measured using Fiji-ImageJ software with the SmartRoot plugin to measure total root length. Morphological data from tolerance testing were analyzed using Two-way ANOVA with R Studio software. When significant differences were found, post-hoc tests were conducted using Duncan Multiple Range Test (DMRT) at a = 0.05.

Introduction of the OsGERLP gene through A. tumefaciens mediation was successfully conducted and produced putative transgenic plants with transformation and regeneration efficiencies of 72.62 and 17.24% respectively for leaf explants, and 71.3 and 87.65% for stem node explants. Total DNA from 7 clones of putative transgenic plants that were successfully isolated was analyzed for DNA integrity by amplifying the actin gene (housekeeping gene). Amplification results with the

ii actin gene using Act-F and Act-R primers produced amplicons of approximately 400 bp, indicating that the isolated DNA had good integrity and was suitable as a template for polymerase chain reaction (PCR). Gene integration analysis in transgenic plants showed that all transgenic clones contained the OsGERLP gene under the control of the 35SCaMV promoter, indicated by the formation of amplicons sized 1500 bp.

In vitro testing the Al-tolerance of transgenic clones showed that transgenic clones had higher tolerance compared to non-transgenic plants. Morphological observations showed that transgenic clones demonstrated better performance in all observed parameters, including plant height, total root length, root number, fresh weight of shoots and roots, as well as dry weight of shoots and roots. Two transgenic clones, CP2OsG2 and CP2OsG3, have the best tolerance to Al stress compared to other clones. Both clones have the potential to be developed into Al stress tolerant potato varieties that can adapt to acid soils.

Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Al stress, genetic transformation, OsGERLP gene, potato cultivar IPB CP2