Suplementasi Paraprobiotik Acinetobacter radioresistens LAZ-2 melalui Pakan sebagai Pencegahan Infeksi Vibrio parahaemolyticus pada Udang Vaname

Abstract

Udang vaname (Litopenaeus vannamei) merupakan jenis udang yang paling banyak dibudidayakan diseluruh dunia. Indonesia turut berkontribusi memenuhi permintaan udang dunia dengan volume ekspor udang yaitu sebesar 165.550 ton pada Tahun 2024. Peningkatan produksi melalui intensifikasi budidaya masih dihadapkan berbagai permasalahan salah satunya serangan penyakit. Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) yang disebabkan oleh Vibrio parahaemolyticus penghasil toksin PirA dan PirB merupakan penyakit yang sering dijumpai pada budidaya udang. Pencegahan dan pengendalian penyakit AHPND perlu melibatkan tindakan biosekuriti yang ketat serta peningkatan manajemen akuakultur untuk mengurangi dampaknya. Salah satu pencegahan penyakit AHPND dapat menggunakan praktik paraprobiotik. Aplikasi paraprobiotik telah dibuktikan secara ilmiah mampu meningkatkan ketahanan inang terhadap penyakit. Penelitian ini didesain untuk menentukkan dosis terbaik suplementasi paraprobiotik Acinetobacter radioresistens LAZ-2 pada pakan untuk meningkatkan performa pertumbuhan, respons imun, ketahanan terhadap penyakit, serta meningkatkan kelangsungan hidup udang vaname yang terserang penyakit AHPND. Hewan uji yang digunakan yaitu udang bersertifikat specific pathogen-free (SPF) dengan berat rerata awal 1,82 ± 0,02 g yang dipelihara di akuarium sebanyak 20 ekor per akuarium. Penelitian terdiri dari lima perlakuan dan tiga ulangan yaitu; Kontrol negatif (KN) pemberian pakan tanpa penambahan paraprobiotik, diinjeksi dengan PBS; Kontrol positif (KP) pemberian pakan tanpa penambahan paraprobiotik, diinjeksi dengan V. parahaemolyticus 105 CFU mL-1; (P106) pemberian pakan dengan penambahan paraprobiotik 106 CFU mL-1 sebanyak 1% (v/w); (P108) pemberian pakan dengan penambahan paraprobiotik 108 CFU mL-1 sebanyak 1% (v/w); (P1010) pemberian pakan dengan penambahan paraprobiotik 1010 CFU mL-1 sebanyak 1% (v/w), masing-masing diinjeksi dengan V. parahaemolyticus RfR 105 CFU mL-1 pada dosis 100 µL per ekor setelah 30 hari diet paraprobiotik dan dipelihara selama 7 hari. Selama uji tantang, semua kelompok menerima pakan komersial dengan frekuensi pemberian empat kali sehari. Bakteri A. radioresistens LAZ-2 dikultur pada media agar sea water complete (SWC) sebagai stok yang digunakan untuk perlakuan. Bakteri kemudian diambil sebanyak 1 ose penuh, diinokulasikan pada SWC broth lalu dikultur pada shaker selama 48 jam. Bakteri yang tumbuh ditandai dengan media yang berubah menjadi keruh. Bakteri hasil kultur di SWC broth diambil sebanyak 1 mL lalu dimasukkan ke dalam microtube. Kemudian dilakukan sentrifugasi yang bertujuan untuk memisahkan supernatan dan pelet. Supernatan yang dihasilkan dibuang sehingga menyisakan pelet saja, lalu ditambahkan PBS dan dihomogenkan dengan vortex. Pencucian dengan PBS dilakukan sebanyak 2 kali. Bilasan terakhir, diambil bakteri yang telah dihomogenkan sebanyak 100 µL dimasukkan ke dalam microtube yang berisi 900 µL PBS untuk pengenceran berseri, kemudian dilakukan Total Plate Count dengan cara bakteri disebar ke media SWC dan diinkubasi 24 jam untuk selanjutnya dilakukan perhitungan kepadatan bakteri. Hasil dari perhitungan bakteri, diperoleh kepadatan bakteri yaitu 1010 CFU mL-1. LAZ-2 selanjutnya dibuat menjadi sediaan paraprobiotik dengan metode heat inactivation menggunakan suhu 95 oC selama 15 menit. Pengecekan bakteri yang telah diinaktivasi dilakukan dengan menumbuhkannya pada media SWC agar. Bakteri yang tidak tumbuh menunjukkan keberhasilan proses inaktivasi dan dapat digunakan untuk perlakuan. Paraprobiotik disemprotkan pada pakan menggunakan sprayer lalu dicampurkan hingga merata serta dikering udarakan selama 15 menit. Penambahan paraprobiotik maupun kontrol PBS pada pakan dilengkapi dengan binder berupa putih telur sebanyak 2 mL per 100 g pakan atau 2% (v/w). Prosedur pembuatan pakan dilakukan setiap tiga hari sekali. Parameter yang diukur meliputi kinerja pertumbuhan (tingkat kelangsungan hidup (TKH), laju pertumbuhan spesifik (LPS), dan rasio konversi pakan (RKP). Aktivitas enzim pencernaan udang meliputi amilase, protease dan lipase. Respons imun meliputi total hemocyte count (THC), respiratory burst (RB), aktivitas phenoloxidase (PO) dan aktivitas fagositosis (AF). Monitoring kelimpahan populasi bakteri pada organ hepatopankreas dan usus; total bacterial count (TBC), total Vibrio count (TVC), dan Vibrio parahaemolyticus RfR count (VpC). Pengamatan histopatologi dan tingkat kelangsungan hidup dilakukan pada hari ke- 7 pasca uji tantang. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pakan yang diberi perlakuan paraprobiotik A. radioresistens LAZ-2 secara signifikan (p<0,05) meningkatkan rata-rata bobot akhir, biomassa akhir, laju pertumbuhan spesifik (LPS), serta menurunkan rasio konversi pakan (RKP) dibandingkan dengan kontrol. Selain itu, aktivitas enzim pencernaan udang (amilase, protease, dan lipase), kelimpahan total bakteri, serta respons imun (total hemocyte count, aktivitas fagositosis, respiratory burst, dan aktivitas phenoloxidase) juga mengalami peningkatan. Di sisi lain, kelimpahan bakteri Vibrio dan Vibrio parahaemolyticus RFR pada organ target udang menurun secara signifikan pada perlakuan paraprobiotik, khususnya pada perlakuan P108 dan P1010. Perlakuan ini menghasilkan tingkat kelangsungan hidup udang yang lebih tinggi (p<0,05) dibandingkan dengan kontrol positif setelah uji tantang yaitu pada perlakuan P108 sebesar 80,00?5,00% dan P1010 sebesar 85,00?5,00%. Hasil pengamatan histopatologi menunjukkan bahwa jaringan hepatopankreas pada perlakuan P106, P108, dan P1010 cenderung normal bila dibandingkan dengan perlakuan kontrol positif (KP). Perlakuan KP menunjukkan kerusakan paling parah pada jaringan hepatopankreas, yang ditandai dengan adanya nekrosis pada tubulus, pelebaran lumen, dan peluruhan sel-sel hepatopankreas. Dosis terbaik suplementasi paraprobiotik A. radioresistens LAZ-2 pada pakan yaitu dengan kepadatan sel 1010 CFU mL-1 dan telah terbukti mampu meningkatkan performa pertumbuhan, respons imun, dapat menekan populasi bakteri patogen, mencegah infeksi V. parahaemolyticus dan meningkatkan tingkat kelangsungan hidup dibandingkan perlakuan kontrol positif.

Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) is the most widely farmed shrimp species globally. Indonesia contributes to meeting global shrimp demand, with an export volume of 165,550 tons in 2024. The increasing in production through intensive aquaculture still faces various challenges, particularly disease outbreaks. One of the most common diseases in shrimp farming is Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND), caused by Vibrio parahaemolyticus producing PirA and PirB toxins. Preventing and controlling AHPND requires strict biosecurity measures and improved aquaculture management to minimize its impact. One potential preventive approach is the application of paraprobiotics. Paraprobiotics have been scientifically proven to enhance host resistance to disease. This study aimed to determine the optimal dose of Acinetobacter radioresistens LAZ-2 paraprobiotic supplementation in feed to improve growth performance, immune response, disease resistance, and survival of white shrimp exposed to AHPND. The experimental animals were Specific Pathogen-Free (SPF) shrimp with an initial average weight of 1.82 ± 0.02 g, maintained in aquaria with 20 shrimp each. The study included five treatments with three replicates: negative control (feed without paraprobiotic, injected with PBS), positive control (feed without paraprobiotic, injected with V. parahaemolyticus 105 CFU mL?¹), and three treatment groups receiving feed supplemented with paraprobiotic at concentrations of 106, 108, and 1010 CFU mL?¹ (1% v/w), respectively, and injected with V. parahaemolyticus RfR 105 CFU mL?¹ (100 µL per shrimp) after 30 days of the paraprobiotic diet. All shrimp were maintained for seven days post-challenge and fed commercial feed four times daily. A. radioresistens LAZ-2 was cultured on sea water complete (SWC) agar and then transferred to SWC broth for 48 hours using a shaker. The culture was centrifuged to separate the pellet, washed twice with PBS, and diluted for bacterial density measurement using Total Plate Count. The culture reached a density of 1010 CFU mL?¹. Paraprobiotics were prepared through heat inactivation at 95 °C for 15 minutes. Successful inactivation was confirmed by the absence of bacterial growth on SWC agar. The paraprobiotics were sprayed onto feed, mixed thoroughly, and air-dried for 15 minutes. Both paraprobiotics and PBS were mixed with egg white as a binder at 2 mL per 100 g feed (2% v/w), and feed preparation was conducted every three days. Measured parameters included growth performance (survival rate, specific growth rate, and feed conversion ratio), digestive enzyme activities (amylase, protease, and lipase), immune responses (total hemocyte count, respiratory burst, phenoloxidase activity, and phagocytic activity), bacterial population in the hepatopancreas and intestine (total Bacterial count, total Vibrio count, and total V. parahaemolyticus RfR count), histopathological observation, and survival rate at day 7 post-challenge. The results showed that feed supplemented with A. radioresistens LAZ-2 paraprobiotics significantly (p<0.05) improved final body weight, final biomass, specific growth rate, and reduced feed conversion ratio. In addition, shrimp showed increased digestive enzyme activities, total bacterial abundance, and enhanced immune responses. The population of total Vibrio and V. parahaemolyticus RfR in target organs significantly decreased, especially in treatments P108 and P1010. These treatments also resulted in significantly higher survival rates (p<0.05), with P108 achieving 80,00?5,00% and P1010 reaching 85,00?5,00%. Histopathological analysis revealed that shrimp in treatments P106, P108, and P1010 had relatively normal hepatopancreas tissues, whereas the positive control group exhibited the most severe damage, including tubule necrosis, lumen dilation, and hepatopancreatic cell sloughing. The best dose of A. radioresistens LAZ-2 paraprobiotic supplementation in feed was found in treatment with a cell density of 1010 CFU mL?¹. This treatment significantly enhanced growth performance, improved immune response, reduced the population of pathogenic bacteria, prevented Vibrio parahaemolyticus infection, and increased survival rate compared to the positive control treatment.