Konservasi Benih Terap (Artocarpus elasticus Reinw. Ex Blume): Masak Fisiologis, Profil Metabolit dan Keragaman Genetik selama Penyimpanan dan Kriopreservasi

Abstract

Terap (Artocarpus elasticus Reinw. ex Blume) is a native Indonesian plant that has not been widely utilized and has potential as a source of food and medicine. Ex-situ conservation had been carried out in the form of field gene banks at the Bogor Botanical Gardens (KRB) and the Mulawarman University Botanical Gardens in Samarinda (KRUS). This conservation needed to be supported by other efforts, namely conventional seed storage and cryopreservation. The general objective of this study was to determine a seed conservation protocol for terap that could support the field gene bank method already implemented in the botanical gardens, with specific objectives: (1) to determine the characteristics of physiological maturity and critical moisture content of terap seeds, (2) to determine the storability of terap seeds using storage media such as vermiculite, moss, and sawdust, (3) to determine the cryopreservation protocol of direct freezing of terap seeds using loading and vitrification treatments, (4) to identify the metabolite profile of terap seeds stored using storage media and cryopreservation, and (5) to identify the genetic stability of terap seeds in storage and cryopreservation. The first stage of the study revealed that terap seeds, which had reached physiological maturity, were derived from orange-colored fruits (100–120 days after anthesis) with a dry weight of 100 seeds at 35.31 g. Physiologically mature seeds had normal seedlings in count I (KNI) at 32 days after sowing (DAS) and KNII at 48 DAS. Germination tests also showed that physiologically mature seeds had a germination rate of more than 75%, a growth rate of 0.63% per day, germination uniformity of 64.44% – 66.67%, and maximum growth potential of more than 82%. The initial moisture content (MC) of terap seeds (at harvest) was 46.28% and the critical moisture content (CMC) was 36.43% - 36.50%, which classified terap seeds as recalcitrant seeds (exceptional species). Recalcitrant seeds were sensitive to desiccation, so seed storage required maintaining moist storage conditions. Storage viability tests showed that vermiculite media was able to keep the MC of terap seeds above the CMC for 2 weeks of storage, but not moss and sawdust media. A decrease in MC below the CMC caused an increase in electrical conductivity, indicating cell membrane leakage. This led to a decline in terap seed viability starting two weeks after storage. The second stage of the study, namely cryopreservation of terap seeds, showed that loading, vitrification, and freezing treatments significantly affected seed viability. Viability tests using tetrazolium (TTZ) showed that several terap seed cells remained alive (bright red) after these three treatments were applied; however, germination tests revealed that terap seeds were unable to germinate again after freezing in liquid nitrogen. A combination of osmotic stress, chemical toxicity, and inadequate cryoprotection caused the loss of viability. These three factors were due to the vitrification treatment being too prolonged and the impermeability of the seed coat (testa). Structural observations revealed that the cryoprotection treatment using the loading solution and Plant Vitrification Solution-2 (PVS2) was not yet optimal, resulting in cell degradation and disintegration during freezing in liquid nitrogen. The third stage of the study involved analyzing the metabolite profile of terap seeds after storage and cryopreservation. The results showed that 246 compounds were identified, belonging to 40 compound groups in the extract of terap seeds stored using storage media. In cryopreserved seeds, 247 compounds were identified, belonging to 39 compound groups. The most dominant compound group in both storage methods was lipids, consisting of fatty acids and fatty esters. Chemometric analysis showed that changes occurred in the metabolite profile of terap seeds stored conventionally with storage media and also with cryopreservation. The analysis results also showed that the compounds that enabled terap seeds to germinate after storage were cis-13,16-docosadienoic acid, methyl ester; butyl 9-cis,11-trans-octadecadienoate; hexadecanoic acid, ethyl ester; and methyl 9-cis,11-trans,13-trans-octadecatrienoate. These four compounds were long-chain unsaturated fatty acids that played an important role in maintaining cell membrane stability in seeds. In seeds stored through cryopreservation, the compounds that caused terap seeds to fail to germinate after storage were Supraene; Hexanoic acid; Linoelaidic acid; Hexanal; Octane, 2,4,6-trimethyl-; Nonanal; and 2,4-Decadienal. These seven compounds were products of cell membrane degradation and cellular responses to freezing stress in liquid nitrogen. The fourth stage of the study involved evaluating genetic diversity in terap seeds during storage and cryopreservation. The results showed that genetic diversity in terap seeds changed during both storage and cryopreservation. The storage treatment (Nei’s genetic diversity (H) = 0.139; Shannon's information index (I) = 0.201) caused a greater reduction in genetic diversity compared to the cryopreservation treatment (H = 0.163; I = 0.244), relative to the control (H = 0.178; I = 0.247). A dendrogram based on Nei's genetic distance grouped all treatments into two major clusters: seeds subjected to storage and seeds subjected to cryopreservation, with a genetic distance of approximately 1.2. These findings indicated that cryopreservation is a more effective method for preserving the genetic diversity of terap seeds compared to conventional storage using storage media. Overall, the four experimental stages provided valuable insights into the physiological, metabolic, and genetic traits of terap seeds, supporting the development of ex-situ conservation strategies. These seeds can serve as genetic resources for future plant breeding programs.

Terap (Artocarpus elasticus Reinw. ex Blume) merupakan tanaman asli Indonesia yang belum banyak dimanfaatkan dan berpotensi sebagai tanaman pangan dan obat. Konservasi secara eks-situ telah dilakukan secara field gene bank di Kebun Raya Bogor (KRB) dan Kebun Raya Universitas Mulawarman Samarinda (KRUS). Konservasi tersebut perlu didukung dengan upaya konservasi lainnya, seperti penyimpanan benih secara konvensional dan kriopreservasi. Tujuan umum penelitian ini ialah menentukan protokol konservasi benih terap yang dapat mendukung metode field gene bank yang telah dilakukan di kebun raya dengan tujuan-tujuan khusus yaitu, (1) menentukan karakter masak fisiologis dan kadar air kritis benih terap, (2) menentukan daya simpan benih terap dengan menggunakan media simpan vermikulit, moss, dan serbuk gergaji, (3) menentukan protokol kriopreservasi pembekuan langsung (direct freezing) benih terap dengan menggunakan perlakuan loading dan vitrifikasi, (4) mengidentifikasi profil metabolit benih terap yang disimpan dengan media simpan dan kriopreservasi, serta (5) mengevaluasi keragaman genetik benih terap dalam penyimpanan dan kriopreservasi. Tahap pertama penelitian menunjukkan bahwa benih terap yang telah mencapai masak fisiologis adalah benih yang berasal dari buah yang berwarna oranye (100–120 hari setelah antesis) dengan bobot kering 100 benihnya adalah 35,31 g. Benih masak fisiologis memiliki kecambah normal hitungan I (KNI) pada 32 hari setelah semai (HSS) dan KNII pada 48 HSS. Uji perkecambahan juga menunjukkan bahwa benih yang masak fisiologis memiliki daya berkecambah lebih dari 75%, kecepatan tumbuh 0,63% etmal-1, keserempakan tumbuh 64,44% – 66,67%, dan potensi tumbuh maksimum lebih dari 82%. Kadar air (KA) awal benih (saat panen) terap adalah 46,28% dan kadar air kritisnya (KAK) adalah 36,43% - 36,50%, yang mengklasifikasikan benih terap sebagai benih rekalsitran (exceptional species). Benih rekalsitran sensitif terhadap desikasi, sehingga penyimpanan benih perlu dilakukan dengan menjaga kondisi penyimpanan tetap lembab. Hasil uji daya simpan menunjukkan bahwa media vermikulit mampu mempertahankan KA benih terap di atas KAK selama 2 minggu penyimpanan tetapi tidak untuk media moss dan serbuk gergaji. Penurunan KA di bawah KAK menyebabkan terjadinya kenaikan daya hantar listrik yang mengindikasikan adanya kebocoran membran sel. Hal tersebut menyebabkan benih terap mengalami penurunan viabilitas sejak dua minggu setelah penyimpanan. Tahap kedua penelitian yaitu kriopreservasi benih terap menunjukkan bahwa perlakuan loading, vitrifikasi, dan pembekuan secara signifikan berpengaruh terhadap viabilitas benih. Uji viabilitas menggunakan tetrazolium (TTZ) menunjukkan bahwa beberapa sel benih terap masih hidup (berwarna merah cerah) setelah diberikan ketiga perlakuan tersebut tetapi uji perkecambahan menunjukkan bahwa benih terap tidak mampu berkecambah kembali setelah perlakuan pembekuan dalam nitrogen cair. Hilangnya viabilitas diakibatkan oleh kombinasi stres osmotik, toksisitas kimiawi dan krioproteksi yang kurang. Ketiga hal tersebut disebabkan oleh kurang optimumnya perlakuan vitrifikasi dan impermeabilitas dari kulit benih (testa). Pengamatan struktural menunjukkan bahwa perlakuan krioproteksi dengan menggunakan larutan loading dan plant vitrification solution-2 (PVS2) belum optimal yang menyebabkan terjadinya degradasi dan disintegrasi sel saat pembekuan dalam nitrogen cair. Tahap ketiga penelitian yaitu identifikasi profil metabolit benih terap setelah penyimpanan dan kriopreservasi. Hasil menunjukkan bahwa teridentifikasi sebanyak 246 senyawa yang termasuk ke dalam 40 kelompok senyawa pada ekstrak benih terap yang telah disimpan dengan media simpan. Pada benih yang disimpan secara kriopreservasi, teridentifikasi sebanyak 247 senyawa yang termasuk ke dalam 39 kelompok senyawa. Kelompok senyawa yang paling dominan pada kedua metode penyimpanan adalah lipid yang terdiri dari asam lemak dan lemak ester. Analisis kemometrik menunjukkan bahwa terjadi perubahan profil metabolit pada benih terap yang disimpan secara konvensional dengan media simpan maupun dengan kriopreservasi. Hasil analisis juga menunjukkan bahwa senyawa-senyawa yang membuat benih terap mampu berkecambah setelah penyimpanan, yaitu cis-13,16-Docasadienoic acid, methyl ester; Butyl 9.cis.,11.trans.-octadecadienoate; Hexadecanoic acid, ethyl ester dan Methyl 9.cis.,11.trans.t,13.trans.-octadecatrienoate. Keempat senyawa tersebut merupakan asam lemak tak jenuh rantai panjang yang memiliki peranan penting dalam menjaga kestabilan membran sel pada benih. Pada benih yang disimpan secara kriopreservasi, senyawa-senyawa yang menyebabkan benih terap tidak mampu berkecambah setelah penyimpanan, yaitu Supraene; Hexanoic acid; Linoelaidic acid; Hexanal; Octane, 2,4,6-trimethyl-; Nonanal; dan 2,4-Decadienal. Ketujuh senyawa tersebut merupakan produk dari degradasi membran sel dan respons sel terhadap stres pembekuan dalam nitrogen cair. Tahap keempat penelitian yaitu evaluasi keragaman genetik benih terap selama penyimpanan dan kriopreservasi. Hasil menunjukkan bahwa terjadi perubahan keragaman genetik pada benih terap selama penyimpanan dan kriopreservasi. Perlakuan penyimpanan (keragaman genetik Nei’s (H) 0,139; indeks informasi Shanon (I) 0,201) menyebabkan penurunan keragaman genetik lebih besar dibandingkan perlakuan kriopreservasi (H= 0,163; I= 0,244) dibandingkan dengan kontrol (H= 0,178; I= 0,247). Dendrogram berdasarkan jarak Nei’s mengelompokkan semua perlakuan menjadi dua kelompok besar yaitu benih dengan perlakuan penyimpanan dan benih dengan perlakuan kriopreservasi dengan jarak genetik sekitar 1,2. Temuan ini mengindikasikan bahwa kriopreservasi merupakan metode yang lebih efektif dalam mempertahankan keragaman genetik benih terap dibandingkan dengan penyimpanan dengan media simpan. Secara keseluruhan empat tahap percobaan ini memberikan informasi mengenai sifat fisiologis, metabolik, dan genetik yang dapat mendukung pengembangan konservasi eks-situ benih terap yang dapat digunakan sebagai sumber daya genetik dalam pemuliaan tanaman di masa yang akan datang.