Bakteri Selulolitik sebagai Agens Hayati Phytophthora capsici serta Analisis Keanekaragaman dan Peran Enzim Endoglukanase

Abstract

Oomycota merupakan salah satu filum yang dapat menyebabkan kerusakan tinggi terhadap tanaman. Filum tersebut memiliki karakteristik berupa komponen dinding sel yang mengandung selulosa. Terdapat berbagai patogen yang menyebabkan kerusakan tanaman yang tinggi pada filum ini, salah satu genus pentingnya adalah Phytophthora. Genus Phytophthora terkenal menyebabkan bencana kelaparan di Irlandia pada 1840-an.

Berbagai pengendalian telah dilakukan seperti penggunaan tanaman resisten, kultur teknis dan penggunaan fungisida. Perbedaan komposisi dinding sel yang dimiliki oleh Oomycota menjadi salah satu pertimbangan penting dalam menentukan strategi pengendalian penyakit yang efektif. Bakteri selulolitik merupakan bakteri yang mampu memproduksi enzim selulase untuk mendegradasi selulosa menjadi glukosa. Hidrolisis selulosa menjadi glukosa oleh enzim selulase berlangsung secara sinergis meliputi tiga enzim yaitu Endo-ß-1,4-glukanase, Exo-ß-1,4-glukanase, dan ß-glukosidase. Dengan mengetahui komposisi dinding sel Oomycota yang mengandung selulosa, maka dapat memanfaatkan bakteri selulolitik yang menghasilkan enzim selulase dalam menghambat pertumbuhan Oomycota. Penelitian ini menggunakan Phytophthora capsici sebagai patogen model Oomycota. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan bakteri penghasil enzim selulase (bakteri selulolitik) dan analisis keanekaragaman genetiknya, memeroleh bakteri selulolitik yang dapat berperan sebagai agens hayati terhadap P. capsici serta mengonfirmasi peran enzim endoglukanase dalam menghambat pertumbuhan P. capsici.

Eksplorasi bakteri selulolitik dan analisis keanekaragaman genetiknya memiliki tahapan penelitian yang meliputi: pengambilan sampel, isolasi bakteri total, seleksi bakteri selulolitik pada media CMC, amplifikasi gen endoglukanase dengan primer endoglukanase EN1F dan EN1R dari endoglukanase milik Bacillus subtilis, dan analisis keanekaragaman genetik endoglukanase. Pengujian bakteri selulolitik sebagai agens hayati Phytophthora capsici meliputi: rejuvenasi isolat P. capsici, rejuvenasi bakteri selulolitik, uji keamanan hayati, uji daya hambat terhadap P. capsici, karakterisai fisiologis bakteri selulolitik, pemilihan isolat menggunakan Analytical Hierarchy Process (AHP), uji fitotoksisitas bakteri selulolitik, uji keefektifan bakteri selulolitik terhadap penyakit busuk pangkal batang cabai, dan identifikasi bakteri selulolitik secara molekuler. Konfirmasi peran enzim endoglukanase meliputi konstruksi mutan yang kehilangan kemampuan selulolitiknya dengan teknik UV mutagenesis. Konstruksi mutan meliputi: rejuvenasi bakteri selulolitik, konstruksi mutan dengan UV mutagenesis, seleksi mutan pada media CMC, uji penghambatan mutan terhadap P. capsici.

Sampel yang digunakan dalam eksplorasi bakteri adalah kayu lapuk, tanah, rayap, sampah organik, feses kambing, kuda, dan sapi. Isolasi mendapatkan 279 bakteri total dengan 72 diantaranya memiliki kemampuan dalam mendegradasi selulosa (selulolitik). Indeks selulolitik yang dihasilkan dari 72 bakteri selulolitik tersebut berkisar 0,222 hingga 10,428. Amplifikasi gen endoglukanase menggunakan primer EN1F dan EN1R asal Bacillus subtilis mendapatkan enam isolat teramplifikasi gen endoglukanase. Enam gen endoglukanase tersebut memiliki kemiripan antar isolat berkisar 79-94%. Hasil analisis domain didapatkan enam endoglukanase memiliki kemiripan dengan protein dari kelompok Cellulase Glycosyl Hydrolase Family 5 (GH5) dan mengandung domain pengikat karbohidrat (Carbohydrate Binding Module_3/CBM_3). Hasil analisis wilayah konservatif dibandingkan dengan endoglukanase GH 5 yang terkarakterisasi menunjukkan adanya wilayah konservatif yang diduga area domain katalitik GH5 dan domain pengikat karbohidrat CBM_3.

Pengujian bakteri selulolitik sebagai agens hayati Phytophthora capsici diawali dengan pengujian keamanan hayati bakteri selulolitik. Sebanyak 36 bakteri selulolitik aman secara hayati dan 26 diantaranya memiliki penghambatan antara 8,15% hingga 79,15%. Lima isolat potensial dipilih berdasarkan kemampuan penghambatan terhadap P. capsici, karakteristik fisiologisnya dan tidak toksik terhadap benih cabai. Lima isolat (S55, K15, S61, FS28 dan S80) diuji keefektifannya terhadap penyakit busuk pangkal batang cabai. Isolat S55 dan K15 menghasilkan tanaman dengan persentase kehidupan yang tinggi, yaitu 86,67% dan 75,56% secara berturut-turut. Identifikasi secara molekuler didapatkan isolat S55 dan S61 memiliki kemiripan yang tinggi terhadap Pseudomonas aeruginosa, K15 terhadap Proteus penneri, FS28 terhadap Bacillus altitudinis, dan S80 terhadap Brevundimonas sp.

Konstruksi mutan dalam konfirmasi peran enzim endoglukanase dalam menghambat Phytophthora capsici dilakukan pada isolat S61, yaitu Pseudomonas aeruginosa. Konstruksi mutan dengan persentase hidup 1% berhasil dilakukan secara konstan menggunakan waktu paparan UV 2 detik. Hasil paparan UV menghasilkan 28 isolat yang tidak lagi bersifat selulolitik. Sebanyak 12 mutan kehilangan kemampuannya dalam menghambat Phytophthora capsici. Hal ini menguatkan dugaan bahwa enzim endoglukanase berperan dalam mekanisme penghambatan terhadap P. capsici.