Pengembangan Metode Autentikasi Sida rhombifolia dan Strobilanthes crispa Menggunakan KLT dan KC-SM/SM dengan Pendekatan Metabolomik

Abstract

Sidaguri (Sida rhombifolia) dan keji beling (Strobilanthes crispa) adalah tumbuhan yang banyak digunakan dalam pengobatan tradisional karena kandungan metabolit bioaktifnya. Sidaguri termasuk dalam famili Malvaceae yang memiliki aktivitas antibakteri, karena kandungan alkaloid dan flavonoid di dalamnya, sedangkan keji beling berasal dari famili Acanthaceae yang mengandung verbaskosida sebagai anti-inflamasi dan anti-kanker. Meski keduanya memiliki manfaat besar dalam pengobatan herbal, keberagaman dan kompleksitas kandungan kimianya mempersulit pengendalian mutu dan penjaminan keamanannya sebagai bahan baku obat. Hal ini menjadi tantangan besar karena produk herbal yang tidak terstandarisasi dapat mempengaruhi kualitas dan keamanan produk. Dalam konteks ini, penting pula untuk mengantisipasi adanya bahan pemalsu yang beredar di pasaran, seperti bunga duha (Turnera subulata) yang sering digunakan untuk menggantikan sidaguri dan sirih hutan (Piper aduncum) sebagai pengganti keji beling, mengingat kemiripan morfologi dan kandungan kimia yang dapat menurunkan mutu dan efektivitas produk herbal tersebut. Pendekatan berbasis senyawa penanda farmakologis sering digunakan untuk mengevaluasi kualitas dan keaslian bahan baku herbal. Namun, kompleksitas komposisi kimia dan keterbatasan literatur tentang senyawa penanda membuat autentikasi sering kali tidak maksimal. Selain itu, pemalsuan bahan baku obat herbal yang beredar di pasaran dapat menurunkan kualitas dan keamanan produk. Oleh karena itu, upaya standardisasi bahan baku dan produk herbal sangat diperlukan untuk memastikan konsistensi khasiat dan keamanannya. Untuk mendukung autentikasi sidaguri dan keji beling, diperlukan pengembangan metode analisis yang dapat mendeteksi ciri spesifik tumbuhan tersebut. Pendekatan metabolomik yang atraktif terhadap perbedaan metabolit, perlakuan biologis atau kondisi tertentu, menawarkan solusi yang dibutuhkan. Metode analisis sidik jari, seperti kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi cair-spektrofotometer massa/spektrofotometer massa (KC-SM/SM), memungkinkan deteksi senyawa-senyawa dalam tumbuhan obat, serta mendeteksi pemalsuan bahan baku. Penelitian ini bertujuan mengembangkan metode autentikasi berbasis metabolomik untuk sidaguri dan keji beling guna memastikan keaslian bahan baku. Kedua tumbuhan ini dipilih karena menjadi prioritas dalam program saintifikasi jamu dari Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. Profil metabolit tumbuhan dapat dianalisis menggunakan pendekatan kualitatif (untargeted) dengan KLT dan KC-SM/SM. KLT efektif untuk evaluasi kualitas dan kendali mutu, sementara KC-SM/SM menawarkan identifikasi dengan sensitivitas tinggi dan mampu memisahkan masing-masing metabolitnya. Sampel daun dari kedua tumbuhan dan spesies berkerabat dekat, seperti sirih hutan (Piper aduncum) dan bunga duha (Turnera subulata), diekstraksi untuk memperoleh metabolit bioaktif. Analisis dilakukan melalui KLT untuk mendapatkan pola sidik jari kimia dan KC-SM/SM untuk identifikasi komposisi metabolit lebih mendalam. Selanjutnya, data yang diperoleh akan dianalisis menggunakan teknik kemometrik seperti principal component analysis (PCA) dan orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) untuk mengelompokkan sampel berdasarkan profil metabolit dan mengidentifikasi metabolit yang berkontribusi pada perbedaan antar-spesies. Hasil analisis sidaguri dan keji beling menggunakan KLT dan KC-SM/SM menunjukkan perbedaan signifikan dalam profil kimia keduanya. Analisis KLT pada sidaguri mengungkapkan dua belas pita kromatografi, sedangkan bunga duha hanya menghasilkan sebelas pita, mencerminkan variasi komposisi yang dipengaruhi oleh faktor lingkungan, dan pita penanda sidaguri dengan nilai Rf masing-masing 0.21 (pita 5), 0.41 (pita 8), dan 0.65 (pita 9) tidak terdeteksi pada bunga duha, menunjukkan karakteristik unik untuk autentikasi. Selain itu, analisis kemometrik menggunakan PCA berhasil memetakan 65% variabilitas data, sementara OPLS-DA menunjukkan nilai R²X sebesar 0.861, memberikan model yang kuat untuk autentikasi dan pencegahan pemalsuan bahan baku herbal. Dalam KC-SM/SM, sidaguri menunjukkan kromatogram base peak dengan pengidentifikasian sebanyak 29 metabolit, termasuk flavonoid, asam lemak, dan ekdisteroid. Model PCA menjelaskan 50% dari variabilitas data, sedangkan OPLS-DA mencatat R²Y yang hampir sempurna di angka 0.999 dan nilai Q² mencapai 0.788, dengan akurasi identifikasi dan prediksi masing-masing sebesar 94.48%. Untuk keji beling, KLT menunjukkan sepuluh pita kromatografi, dengan Rf penanda sebesar 0.41 (pita 6), 0.63 (pita 8), dan 0.81 (pita 10) yang tidak ditemukan dalam sirih hutan, serta mampu memetakan 74% dari total variabilitas dalam dua komponen utama, sedangkan OPLS-DA mencapai nilai R²X 0.999 yang menjelaskan hingga 99.9%, dan R²Y 0.743, mencerminkan kemampuan model dalam menjelaskan 74.3% variabilitas dalam variabel target. Dalam analisis KC-SM/SM, kromatogram base peak menunjukkan 20 metabolit teridentifikasi, dengan analisis menyatakan perbedaan signifikan dalam intensitas puncak metabolit dalam rentang waktu retensi antara 1 hingga 15 menit dan 16 hingga 30 menit. Model PCA KC-SM/SM menunjukkan persentase varians yang dijelaskan sebesar 54%, dan OPLS-DA menunjukkan R²X 0.696 dan R²Y 0.999 dengan kemampuan pengenalan sebesar 98.75%. Dalam evaluasi model klasifikasi untuk keji beling, support vector machine (SVM) terbukti menjadi algoritma paling efektif dengan akurasi tertinggi mencapai 96.4% dan area under the curve - receiver operating characteristic (AUC-ROC) mendekati 1 (0.998). Keseluruhan hasil analisis mengindikasikan bahwa kombinasi KLT dan KC-SM/SM dengan pendekatan analisis kemometrik serta machine learning sangat efektif dalam identifikasi dan diskriminasi untuk sidaguri dan keji beling, memberikan dasar yang kuat untuk pengembangan teknik autentikasi yang merupakan bagian dari pengendalian kualitas bahan baku herbal, serta mendukung program standardisasi jamu oleh Kementerian Kesehatan Republik Indonesia.

Sida rhombifolia (commonly known as sidaguri) and Strobilanthes crispa (keji beling) are medicinal plants widely utilized in traditional medicine due to their rich content of bioactive metabolites. Sida rhombifolia, belonging to the Malvaceae family, exhibits antibacterial activity attributed to its alkaloid and flavonoid constituents, while Strobilanthes crispa, a member of the Acanthaceae family, contains verbascoside known for its anti-inflammatory and anticancer properties. Despite their therapeutic potential, the diversity and complexity of their chemical constituents pose significant challenges in quality control and safety assurance when used as raw materials for herbal medicine. This issue becomes more critical in the context of unstandardized herbal products, which may compromise both quality and safety. Furthermore, it is important to anticipate the presence of adulterants in the herbal raw material supply chain, such as Turnera subulata (bunga duha), which is often used as a substitute for S. rhombifolia, and Piper aduncum (sirih hutan) as a replacement for S. crispa, due to their morphological similarities and overlapping chemical profiles that may potentially reduce the quality and therapeutic efficacy of herbal preparations. A pharmacological marker compound-based approach is often employed to assess the quality and authenticity of herbal raw materials. However, the chemical complexity and limited availability of marker compound references frequently hinder optimal authentication. In addition, the circulation of adulterated herbal raw materials further threatens product quality and consumer safety. Therefore, the standardization of raw materials and herbal products is urgently needed to ensure consistent efficacy and safety. To support the authentication of S. rhombifolia and S. crispa, it is essential to develop analytical methods capable of detecting species-specific chemical features. A metabolomics-based approach, which captures the variation in metabolite composition due to biological or environmental factors, offers a promising solution. Fingerprinting techniques such as thin-layer chromatography (TLC) and liquid chromatography–mass spectrometry/mass spectrometry (LC-MS/MS) enable the detection of characteristic compounds and facilitate the identification of adulterants. This study aims to develop a metabolomics-based authentication method for S. rhombifolia and S. crispa to ensure the authenticity of herbal raw materials. These species were selected as priorities in the Indonesian Ministry of Health’s jamu (traditional herbal medicine) standardization program. Metabolite profiling was performed using untargeted approaches with TLC and LC-MS/MS. TLC was utilized for quality evaluation and routine control, while LC-MS/MS provided highly sensitive identification and resolution of individual metabolites. Leaf samples of the target species and their respective adulterants—Piper aduncum and Turnera subulata—were extracted to obtain bioactive metabolites. TLC was employed to generate chemical fingerprints, while LC-MS/MS enabled more comprehensive metabolite identification. The resulting data were subjected to chemometric analyses, including principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA), to classify samples based on metabolite profiles and identify discriminatory metabolites between species. The analysis of S. rhombifolia and S. crispa using TLC and LC-MS/MS revealed substantial differences in their chemical profiles. TLC analysis of S. rhombifolia showed twelve chromatographic bands, while T. subulata yielded only eleven, reflecting compositional variations likely influenced by environmental factors. Notably, marker bands with Rf values of 0.21 (band 5), 0.41 (band 8), and 0.65 (band 9) were absent in T. subulata, indicating species-specific features for authentication. PCA successfully captured 65% of the data variability, and OPLS-DA yielded an R²X value of 0.861, suggesting a robust model for authentication and adulteration detection. In LC-MS/MS, S. rhombifolia exhibited a base peak chromatogram comprising 29 identified metabolites, including flavonoids, fatty acids, and ecdysteroids. The PCA model explained 50% of data variance, while OPLS-DA demonstrated near-perfect classification with R²Y = 0.999 and Q² = 0.788, achieving 94.48% accuracy in both identification and prediction. For S. crispa, TLC revealed ten chromatographic bands, with marker Rf values at 0.41 (band 6), 0.63 (band 8), and 0.81 (band 10), which were not detected in P. aduncum. PCA mapped 74% of the total variability in two principal components, and OPLS-DA explained 99.9% of X variability (R²X = 0.999) and 74.3% of Y variability (R²Y = 0.743). In LC-MS/MS analysis, the base peak chromatogram indicated the presence of 20 identified metabolites. Significant differences were observed in peak intensity across retention times of 1–15 and 16–30 minutes. The LC-MS/MS PCA model explained 54% of the variance, while OPLS-DA achieved R²X = 0.696 and R²Y = 0.999 with a recognition rate of 98.75%. Among classification algorithms tested for S. crispa, support vector machine (SVM) proved to be the most effective, with the highest accuracy of 96.4% and an area under the curve–receiver operating characteristic (AUC-ROC) approaching 1 (0.998). Overall, the results indicate that combining TLC and LC-MS/MS with chemometric and machine learning approaches offers a powerful and reliable strategy for the authentication and discrimination of S. rhombifolia and S. crispa, thereby providing a solid foundation for quality control measures and supporting the herbal standardization efforts of the Indonesian Ministry of Health.