Molecular and Morphological Characterization of Indonesian Foxtail Millet (Setaria italica) Genotypes Related to Feedstock Quality Improvement

Abstract

Foxtail millet (Setaria italica), a resilient C4 crop, shows great potential for adaptation to environmental stress due in part to lignin, a key structural polymer influencing plant stress tolerance and lodging resistance. This study focuses on Si4CL1, a gene encoding 4-coumarate-CoA ligase, a critical enzyme in the lignin biosynthetic pathway. Using in silico approaches, we analyzed whole-genome sequence (WGS) and RNA sequencing (RNA-seq) datasets to identify variation in Si4CL1 across global foxtail millet genotypes. Complementary analysis was conducted on the nine Indonesian genotypes using PCR amplification and Sanger sequencing. The functional effects of these variants were predicted using SnpEff, and protein structural models were constructed using Phyre2. A total of 50 and 1,359 variants were identified from WGS and RNA-seq, respectively. Most intronic SNPs and all INDELs were only found in Indonesian genotypes, absent in public SRA datasets. One intronic SNP (Chr1:6,151,415) was predicted to affect splicing but caused minor protein structural changes. All exonic SNPs were present in WGS with minor allele frequencies above 25%, with low to moderate putative impact levels. Non-synonymous SNPs were located outside the catalytic domain, implying minimal impact on Si4CL1 enzymatic function.

Abstract 2 Foxtail millet (Setaria italica) holds great potential for use as food and feedstock for biofuel or animal feed. Feedstock with high cellulose but low lignin content is more desirable for biofuel or feed. This study aims to obtain phenotypic variation in Indonesian foxtail millet genotypes related to their utilization as feedstock. Using a randomized complete block design with one factor and three replications. Acid detergent fiber (ADF) percentage, cellulose content, lignin content, number of leaves, and plant height have high potential for selection criteria for foxtail millet superior variety development for feedstock. These traits exhibited sufficient broad-sense heritability, along with moderate to high genotypic and phenotypic coefficients of variation (GCV and PCV), with a low difference between them, indicating strong genetic influence determining phenotype. Heatmap clustering and principal component analysis (PCA) showed the presence of genotypic variability, allowing for effective genotype selection based on traits relevant to feedstock quality. Among the genotypes evaluated, Hambapraing, Mauliru2, and ICERI7 emerged as parental candidates with desired traits for feedstock quality improvement.

Hotong (Setaria italica) merupakan tanaman dengan toleransi terhadap cekaman dari lingkungan akibat adanya peran lignin, struktur polimer yang mempengaruhi toleransi cekaman dan tahan rebah pada tanaman. Penelitian ini fokus pada Si4CL1, gen yang menyandikan 4-coumarate-CoA ligase, yang merupakan enzim penting dalam lintasan biosintesis lignin. Analisis set data whole-genome sequence (WGS) dan RNA sequencing (RNA-seq) dengan melalui pendekatan in silico dilakukan untuk mengidentifikasi variasi basa Si4CL1 dari berbagai genotipe hotong di dunia. Analisis pada sembilan genotipe hotong Indonesia melalui PCR dan Sanger sequencing juga dilakukan. Efek fungsional akibat variasi basa diprediksi menggunakan SnpEff, dan model struktur protein dibuat menggunakan Phyre2. Sejumlah 50 dan 1,359 variasi basa ditemukan dari data WGS dan RNA-seq secara berturut-turut. Sebagian besar SNP dan semua INDEL di bagian intron hanya ditemukan pada genotipe hotong dari Indonesia, dan tidak ada di set data SRA. Salah satu SNP di intron (Chr11:6,151,415) diperkirakan berpengaruh pada pola splicing yang berakibat pada perubahan struktural minor pada protein. Seluruh SNP di ekson juga ditemukan pada set data WGS dengan frekuensi alel minor di atas 25%, dengan tingkat pengaruh yang diduga rendah hingga sedang. SNP non-sinonim terletak di bagian luar domain katalitik menunjukkan pengaruh yang minim pada fungsi enzimatik Si4CL1.

Abstrak 2 Hotong memiliki memiliki potensi besar sebagai sumber bahan baku (feedstock), baik sebagai bahan bakar hayati maupun pakan ternak. Feedstock dengan kandungan selulosa tinggi dan lignin rendah lebih diharapkan untuk bahan bakar hayati maupun pakan ternak. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh variasi fenotipik pada genotipe hotong Indonesia terkait pemanfaatannya sebagai feedstock. Percobaan disusun menggunakan rancangan kelompok lengkap teracak dengan satu faktor dan tiga ulangan. Persentase acid detergent fiber (ADF), kandungan selulosa, kandungan lignin, jumlah daun, dan tinggi tanaman merupakan karakter yang berpotensi menjadi kriteria seleksi dalam perakitan varietas unggul hotong sebagai feedstock. Karakter-karakter tersebut menunjukkan heritabilitas arti luas yang tinggi serta nilai koefisien keragaman genetik dan fenotipik (KKG dan KKF) yang sedang hingga tinggi, dengan selisih yang rendah antara keduanya, mengindikasikan kontrol genetik yang lebih kuat dibandingkan pengaruh lingkungan dalam menentukan fenotipe. Hasil analisis klaster (heatmap) dan analisis komponen utama (PCA) menunjukkan adanya keragaman genetik, yang memungkinkan seleksi genotipe secara efektif berdasarkan karakter-karakter yang relevan dengan kualitas feedstock. Genotipe Hambapraing, Mauliru2, dan ICERI7 terpilih sebagai kandidat tetua dengan karakter yang sesuai untuk peningkatan kualitas feedstock.