Functional Recombinant DNA Polymerase from Hyperthermophilic Crenarchaeon Sulfurisphaera javensis strain KD-1T

Abstract

DNA polymerases are essential enzymes in DNA replication and repair, and they are widely used in molecular biology for in vitro DNA amplification using polymerase chain reaction (PCR). Most commercially available DNA polymerases, including Taq, Pfu, KOD, and Vent, originated from thermophilic bacteria and Euryarchaeota. Despite the wide variety of DNA polymerases available, ongoing challenges such as amplifying high GC-content DNA or long fragments persist. Therefore, research on discovering novel thermostable polymerases with improved properties is still growing. This study aimed to clone and express a previously unexplored family B DNA polymerase (DNA polymerase II) from Sulfurisphaera javensis, a hyperthermoacidophilic Crenarchaeon isolated from Domas Crater, West Java, Indonesia. S. javensis DNA polymerase II has been successfully cloned into the pET28a vector and expressed in Escherichia coli BL21(DE3)pLysS, achieving the best expression when induced with 0.5 mM IPTG at 30 ºC for 16 hours. The recombinant protein has been purified using His-tag purification in a HisTrapTM column via immobilized metal affinity chromatography, possesses a molecular weight of ~92 kDa, withstands high temperature, and can amplify ~800 bp DNA fragment using PCR. Bioinformatics analysis and 3D structure modelling identified conserved family B polymerase and 3'-5' exonuclease motifs, supporting its predicted activity. This study represents the first successful expression and functional activity of recombinant S. javensis DNA polymerase, opening chances for further biotechnology applications.

DNA polimerase Adalah enzim penting pada replikasi dan perbaikan DNA. Enzim ini banyak digunakan pada biologi molekuler untuk melakukan amplifikasi DNA secara in vitro menggunakan polymerase chain reaction (PCR). Sebagian besar DNA polimerase komersial seperti Taq, Pfu, KOD, dan Vent berasal dari bakteri termofilik dan Euryarchaeota. Meskipun telah terdapat banyak jenis DNA polimerase, kesulitan untuk mengamplifikasi template DNA dengan GC tinggi atau fragmen panjang masih menjadi tantangan. Maka dari itu, penelitian untuk mendapatkan DNA polimerase termostabil baru dengan karakteristik yang lebih baik masih terus dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan kloning dan ekspresi DNA polimerase famili B (DNA polimerase II) dari Sulfurisphaera javensis, Creanarchaea hipertermoasidofilik yang diisolasi dari Kawah Domas, Jawa Barat, Indonesia. DNA polimerase dari S. javensis telah berhasil diklon pada pET28a dan diekspresikan pada Escherichia coli BL21(DE3)pLysS. Ekspresi paling optimum didapatkan dengan konsentrasi induksi IPTG sebesar 0,5 mM dengan suhu inkubasi 30 ºC selama 16 jam. Protein rekombinan telah dipurifikasi menggunakan purifikasi His-tag dengan kolom His-TrapTM menggunakan kromatografi afinitas logam terikat, memiliki ukuran molekul sebesar ~92 kDa, dapat bertahan pada suhu tinggi, dan bisa mengamplifikasi fragmen DNA berukuran ~800 bp menggunakan PCR. Analisis bioinformatika dan pemodelan struktur 3D mengidentifikasi motif polimerase dan 3'-5' eksonuklease konservatif dari DNA polimerase famili B, sesuai dengan aktivitas yang dimiliki. Penelitian ini menunjukkan keberhasilan ekspresi dan aktivitas fungsional dari DNA polimerase rekombinan asal S. javensis, yang dapat bermanfaat untuk aplikasi bioteknologi.